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硫黄素T检测

2021-05-08
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硫黄素T (Thioflavin T) 是一种荧光染料,可以和富含β折叠的结构结合,例如α-突触核蛋白纤维原、Tau纤维原等。一旦结合,硫黄素T的发射光谱就会发生红移 ,并且荧光强度会增强,这是一个很好的用来检测纤维原形成的测试。以下操作指南是用α-突触核蛋白前体纤维原和单体做的硫黄素T检测。


1.用蒸馏水制备 1mM 硫黄素T储备溶液 (新鲜制备并使用 0.2μm 注射器过滤器过滤)。

2.用PBS pH 7.4稀释硫黄素T,确保每个孔中的硫黄素T最终浓度为 25 μM (每孔溶液体积= 100 μL). 孔板: Lumox 96 多孔孔板 (Sarstedt Catalog # 94.6000.024).

3.在将要使用之前才把alpha突触核蛋白小份在室温下解冻。

4.在相应的孔中加入 10 nM 前体纤维原或者100 μM 单体 (或两者都有). 用移液器将孔中液体上下吸入排出混合. 浓度为估计值,需要优化来得到好的信号,并避免浪费.

5.密封孔板然后置于震荡孵育器中 (600 rpm),37°C孵育.

6.用 Molecular Devices Gemini XPS 微孔板读板机读取荧光读数,使用软件是 Softmax Pro 版本为 6.5.1.


XPS 酶标仪设置参数:


  温度: 37°C

  读取形式: 孔板扫描

  波长: 激发光 450 nm,发射光 485 nm

  PMT 增益: 自动

  闪光每读: 6

  震荡: 读数前20 秒


7.再次密封孔板置于震荡孵育器下 37°C.

8.1 到 72 小时常规区间读数.


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