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ELISpot

2021-05-18
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酶联免疫斑点检测法(Enzyme-Linked ImmunoSpot, EILSpot)是在单细胞水平检测细胞分泌物的一种高灵敏度的检测方法。
ELISpot



图一
1.固定特异性单克隆抗体在96孔ELISpot板上。
2.分别加入有特异性刺激因子和无刺激因子的细胞。
3.孵育过程中,细胞被刺激因子激活开始分泌细胞因子,细胞因子和单克隆抗体结合。
4.移除细胞,加入交联生物素或酶的检测单克隆抗体。
5.如果使用交联生物素的单克隆抗体检测,加入链霉亲和素酶联物。
6.最后,加入底物,细胞分泌位点会形成有色斑点。
7.计算实验组和对照组斑点数量。



ELISpot是迄今为止细胞分析最敏感的方法之一,它以细胞因子为分析对象,比传统的ELISA方法敏感20-200倍。ELISpot和RT-PCR敏感性相当,不同的是ELISpot检测的是分泌蛋白而不是mRNA。 ELISpot分析细胞因子有很大优势,细胞因子分泌后可立即被连接到捕获抗体上,因此很少会被结合蛋白和活性蛋白酶破坏。ELISpot具有较高的灵敏性,特别适用于细胞因子含量较低时的检测,例如特异性免疫反应的定期检测等。

应用
ELISpot分析方法被广泛应用于感染引起的特异性免疫反应、癌症、过敏、自身免疫疾病。它是研发和检测新疫苗和候选疫苗的标准方法。ELISpot通过细胞因子分析也能用来鉴别T细胞的亚型,例如,Th1细胞产生IFN-γ、IL-2 和TNF-α,而Th2细胞产生IL-4、IL-5 和 IL-13。ELISpot既可以进行单个实验也能进行大规模试验。和四聚体法(检测细胞毒性T淋巴细胞反应)相比,进行大规模试验时ELISpot不许需要提前表位鉴定和MHC-Ⅰ型限制。对实验设备要求比较低,适合于实地研究。随后,以ELISpot为平台的诊断测试也相继出现,它通过检测结核杆菌抗原刺激T细胞后的分泌物IFN-γ判断病人是否感染结核或携带者。ELISpot比皮肤测试有更高的灵敏性和特异性,不会混淆之前接种的BGC疫苗。ELISpot可以应用于许多物种,除了人、猴子、小鼠、大鼠细胞之外,还可应用于兽医学,评价牛、羊、马、猪来源的T细胞反应。

疫苗开发
IFN-γ ELISpot被应用于许多大规模试验用于监测HIV候选疫苗,评价HIV疫苗和其它病原体及肿瘤疫苗(见图2)。ELISpot还可检测疫苗的功效,从而评估疫苗的设计方法是否合适。除了可以检测IFN-γ,ELISpot还可检测其它细胞毒性关键因子,例如:穿孔蛋白、颗粒酶B。


ELISpot



图2.肽刺激T细胞后用ELISpot分析人IFN-γ。CD8+ T用来源于病毒的MHC-Ⅰ型限制肽刺激16小时,同时设置阴性对照(不刺激)。


过敏反应
ELISpot可应用于过敏研究,过敏研究中的Th2反应至关重要,但是反应频率比较低,因此就需要高灵敏的方法来检测Th2反应。ELISpot还可在特异性免疫治疗中监测T细胞反应,开发体外诊断测试方法等。ELISpot常用于检测IL-4,IL-4是Th2型反应的主要细胞因子,用流式和ELISA检测时常常由于灵敏性低导致实验失败(见图3)。

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图3.外周血单核细胞对镍体外过敏反应。斑点测试反应显示+++ (n=10), ++ (n=11), + (n=10) , 0 (controls; n=10)。单核细胞中加入50 μM NiCl2孵育40小时,31个过敏个体用ELISpot可检测到23个,而ELISA只检测到4个阳性反应。


其它类型细胞分析
最初,ELISpot用于计算细胞分泌的特异性抗体。近几年,B细胞ELISpot的发展,使ELISpot技术得以复苏,主要用于检测B细胞感染反应和疫苗引起的感染。
从理论上讲,ELISpot可以应用于任何单细胞水平的检测。例如脂多糖刺激外周血单核细胞分泌的IL-1β和 IL-6定量研究(见图4.)。还可用于少数细胞的研究,例如浆细胞样树突状细胞,它在血液中的出现频率很低,但用ELISpot可以很容易检测到它的产物IFN-α。

ELISpot


图4. ELISpot分析脂多糖刺激人外周血单核细胞后分泌的IL-1β 和 IL-6。加入脂多糖(100ng/ml)后孵育细胞(5,000 cells/well)20小时,设实验组和对照组。

技术


试验方法优化
ELISpot方法有几个关键步骤,高特异性抗体选择是最重要的一步,其它关键参数包括ELISpot板的选择、包被程序等。包被前PVDF板用乙醇处理,可以增加联接捕获抗体的能力。事实上,不同的板子对乙醇的反应也不一样,因此选择合适的方法很关键。如果乙醇处理恰当,斑点的质量和数量比未经乙醇处理的要好很多。值得注意的是,过度乙醇处理(乙醇体积过大或时间过长)会降低实验效率(见图5)。
捕获抗体一般推荐15μg/ml(100μl/well),如果捕获抗体浓度小于15μg/ml,斑点会呈弥散状,影响后续计算。在许多细胞因子ELISpot实验中,捕获抗体数量越少,斑点的损失就越大。因此,设计试验时要考虑到捕获抗体的数量,尤其是生成细胞频率较低或细胞因子数量较少时。
最后一步加入沉淀底物,不同的酶(ALP或HRP)使用不同的底物,不同的底物产生不同的颜色,而且灵敏度也不一样(见图6)。一般情况下,我们推荐ALP 使用BCIP/NBT;HRP 使用TMB。这两种酶的灵敏性非常好,都可以产生清晰的斑点。


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图 5. 包被前乙醇处理MSIP对结果的影响,Mabtech预包被板的比较。用CEF肽刺激人的外周单核细胞(250,000 cells/well),然后检测IFN-γ产量。

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图6. ELISpot通用底物。不同的酶(ALP 或 HRP)交联不同的底物。以IFN-γ ELISpot为例,ALP使用BCIP/NBT,HRP 使用TMB 和AEC。
 


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