RIG-I 与 STING 的联盟
 
天然免疫系统对于限制病毒感染作用重大。其依靠若干组模式识别受体（PRRs）来识别病毒核酸¹。这些PRRs包括胞浆DNA感受器（CDS），环鸟苷酸腺苷酸合成酶（cGAS），和细胞质RNA感受器视黄酸诱导基因I（RIG-I）。这些受体一旦被活化，将诱导不同的信号通路导致一系列抗病毒分子的产生。有趣的是，有证据表明，这些信号通路之间存在紧密联系以增强抗病毒反应。
 

感受器cGAS和RIG-I通过单独的接头蛋白来识别不同的核酸和信号。cGAS感受细胞质中异常DNA的存在和浓度，而后通过环二核苷酸2’3’-cGAMP²募集干扰素基因刺激因子（STING, or MITA/ERIS/MPYS）。RIG-I检测出5`-二/三磷酸末端未加帽的病毒RNA和短平末端双链部分的病毒RNA后，其与线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS, or IPS-1/VISA/Cardif)1结合。它们激活后，cGAS/STING和RIG-I/MAVS将触发共同的信号级联反应导致I型干扰素（IFNs）和促炎性因子的产生。

在不同水平上均有报道称RNA和DNA通路之间存在复杂的相互作用。首先，若干组数据表明在人源细胞中，胞浆中富含AT的DNA以一种RIG-I/MAVS依赖的方式导致了I型干扰素的产生，而在小鼠细胞中则没有^3-5。虽然RIG-I和dsDNA之间显示有直接的相互作用6，但是RIG-I的这种识别作用需要poly(dA:dT)通过RNA聚合酶III的转录作用实现^4,5。此外，在STING缺失细胞中，应答胞浆双链RNA和病毒感染时I型干扰素产量的减少和免疫共沉淀实验中STING和RIG-I的直接结合共同证明STING参与RIG-I/MAVS应答途径^7,8。已发表的数据表明，STING作为共同接头蛋白与MAVS在线粒体相关内质网膜（MAM）形成复合物，从而活化RIG-^I7,9。此外，cGAS参与反转录病毒RNA10和胞浆RNA：DNA杂合体的识别¹¹，并在晶体结构研究中显示其与合成RNA结合¹²。

除调节器与RNA和DNA途径物理上的互作之外，STING和RIG-I表达水平上的协同调节也有描述。事实上，合成的或病毒激动剂激活RIG-I后可诱导STING表达¹³，反之亦然，STING活化的下游信号通路可诱导RIG-I的表达，有趣的是，上调的RIG-I参与STING表达的负反馈调节以防止过度的免疫反应¹⁴。

总之，cGAS/STING和RIG-I/MAVS在生理和功能上是相互联系的。RNA和DNA检测中的互作和随后的信号级联反应在应对微生物核酸的多样性和抵抗病毒逃逸机制上都是至关重要的。此外，RIG-I和STING之间的互作可能有助于平衡细胞的抗病毒反应和自身节律。值得注意的是，RIG-I和STING之间的互作在物种和细胞类型之间差异很大，这可能反映了病毒及其目标细胞间的协同进化作用。核酸感应途径的激动剂或抑制剂的未来发展需要严格检查其对每个核酸感受器的影响。

RIG-I 信号通路
RIG-I 配体 

• 5’ppp-dsRNA
5’ppp-dsRNA 是一种5’三磷酸双链RNA，通过一个由19个核酸分子通过磷酸二酯键聚合成的5`三磷酸单链RNA和其非三磷酸互补链杂交形成。5’ppp-dsRNA的序列可以通过筛选各种序列突变体确定。未加帽的5’三磷酸双链RNA能够被RIG-I特异性识别。

• 3p-hpRNA
3p-hpRNA是通过体外转录甲型流感病毒（H1N1）序列而产生的5’三磷酸发夹RNA。这个有87个核酸分子的RNA寡核苷酸含有未加帽的5`三磷酸酯末端和双链片段，它们是RIG-I识别的特征结构。3p-hpRNA是RIG-I的一种有效并特异性的激动剂。


RIG-I/MAVS 报告基因细胞

InvivoGen提供一系基于人源肺癌细胞株A549，小鼠巨噬细胞RAW和人源胚肾细胞HEK293稳转细胞系，助力RNA感受器RIG-I信号通路的研究。这些细胞系包括RIG-I或MAVS基因的敲除细胞株（衍生自A549或RAW细胞系）或者RIG-I基因的过表达细胞株（衍生自HEK-293细胞系）。

• A549-Dual™

• A549-Dual™ KO-RIG-I 

• A549-Dual™ KO-MAVS

• HEK-Lucia™ Null

• HEK-Lucia™ RIG-I

• RAW-Lucia™ ISG

• RAW-Lucia™ ISG KO-RIG-I

• RAW-Lucia™ ISG KO-MAVS

描述
所有的RIG-I/MAVS报告基因细胞系均表达一个含有分泌型荧光素酶基因ISG（干扰素刺激基因）诱导型构件。活化RIG-I/MAVS信号通路可诱导ISG启动子的活化并产生荧光素酶，该酶存在于细胞上清并能够通过荧光素酶检测试剂QUANTI-Luc™检测定量。源于A549的细胞携带一个额外的NF-κB诱导表达分泌型碱性磷酸酶（SEAP）基因构件，该酶的活性能够通过SEAP检测试剂QUANTI-Blue™检测定量。
这些RIG-I/MAVS报告基因细胞株携带Zeocin™单抗性基因或Zeocin™和Blasticidin（参见最后一页）双抗性基因。

结果
使用RIG-I激动剂，复合了LyoVec™的5’ppp-dsRNA和3p-hpRNA刺激A549-Dual™和RAW-Lucia™ ISG细胞系，ISG应答显著。在A549-Dual™细胞中3p-hpRNA激动性强度明显高于5’ppp-dsRNA，30 ng/ml的3p-hpRNA复合物活化信号已明显高于300 ng/ml 5’ppp-dsRNA的复合物。相反，在RIG-I-KO或MAVS-KO细胞株中应答消失。使用RIG-I配体刺激HEK-Lucia™对照细胞时ISG反应很弱。而在HEK-Lucia™ RIG-I细胞中，由于RIG-I基因的组成型过表达导致这种应答尤为强烈。同样，当使用3p-hpRNA和5’ppp-dsRNA时观察到更高水平的ISG应答。在衍生自A549的细胞株中NF-κB对于RIG-I配体的反应跟ISG应答是相似的，虽然前者更弱一些（参考网站数据）。



ISG对RIG-I配体的反应：使用300 ng/ml的5’ppp-dsRNA或30 ng/ml的3p-hpRNA刺激衍生自A549的细胞；使用1 μg/ml 5’ppp-dsRNA或3p-hpRNA刺激衍生自RAW和HEK293的细胞。经过孵育过夜，可使用QUANTI-Luc™检测上清中Lucia荧光素酶活性的相对光单位（RLUs）以测试ISG的反应。

相关产品

STING 突变株

STING SAVI 报告基因细胞株

InvivoGen提供给一系列基于人源THP1单核细胞系的STING突变体的报告基因细胞株。其中，有两款表达STING- associated vasculopathy with onset in infancy（SAVI）的功能获得性突变体(S154 and M155)。SAVI患者在STING蛋白中显示出单一突变，导致其持续激活和ISG的过度活化。S154是新生突变1，M155是遗传突变2。STING SAVI报告基因细胞株是筛选STING通路抑制剂便捷有力的工具。
• THP1-Dual™ KI-hSTING-S154     • THP1-Dual™ KI-hSTING-M155

描述
THP1-Dual™ KI-hSTING-S154细胞和THP1-Dual™ KI-hSTING-M155细胞均来自THP1-Dual™ KO-STING细胞，该细胞衍生自THP-1细胞，稳定敲除了内源性人源STING的双等位基因并稳定整合了两种可诱导分泌的报道基因（Lucia萤光素酶和SEAP（分泌型胚胎碱性磷酸酶）。THP1-Dual™ KO-STING细胞敲入了“野生型”R232人源STING突变体3的无内含子编码序列和一个S154 或M155突变位点。IRF3和NF-κB通路能够通过分别测试Lucia荧光素酶或SEAP活性进行检测。细胞培养上清中的报告基因蛋白活性能够使用QUANTI-Luc™ and QUANTI-Blue™检测试剂进行检测。SAVI报告基因细胞对Blasticidin和Zeocin™有抗性。

结果
功能获得(Gain-of-function)的活化-THP1-Dual™ KI-hSTING-S154细胞和THP1-Dual™ KI-hSTING-M155细胞均均可以持续活化ISG，而THP-1-Dual™ KI-hSTING-R232却不能。加入IFN-β或STING激动剂将进一步促进ISG的活化。注意，结果已被非刺激细胞背景信号标准化。因为其持续活化STING的特性，SAVI细胞的背景非常高，诱导ISG应答的增加倍数低于R232对照细胞。
抑制剂功能-加入TBK-1抑制剂BX795，或Brefeldin A，一种抑制蛋白从ER转运到高尔基体的蛋白转运抑制剂，能够显著抑制SAVI细胞中STING信号的转导。所以，这些细胞能够用于筛选STING的抑制剂。

1. Munoz J. et al., 2015. Stimulator of interferon genes-associated vasculopathy with onset in infancy: a mimic of childhood granulomatosis with polyangiitis. JAMA Dermatology 151: 872-7.

2. Jeremiah N. et al., 2014. Inherited STING-activating mutation underlies a familial inflammatory syndrome with lupus-like manifestations. The Journal of Clinical Investigation 124: 5516-20.

3. Yi G. et al., 2013. Single nucleotide polymorphisms of human STING can affect innate immune response to cyclic dinucleotides. PLOS ONE 8: e77846。

相关产品

对IFN-β或STING激动剂的ISG应答：使用104 U/ml IFN-β, 10 μg/ml 2’3’ cGAMP或2’3’ cGAMP(PS)2(Rp/Sp), 30 μM BX795 or 10 μg/ml Brefeldin A刺激衍生自THP1-Dual™细胞。孵育过夜后，通过使用QUANTI-Luc™检测上清中Lucia荧光素酶活性测试ISG应答。Bar值表示非刺激细胞中背景信号标准化的活性百分比。


STING 筛选服务
InvivoGen提供一系列STING筛选服务的选择，用于鉴定激活或抑制一些STING突变体的分子。欲知更多信息请联系我们。 


重组人源 STING 蛋白
STING通过胞浆区域与CDNs结合。InvivoGen提供的重组STING蛋白对应可溶性的胞浆结构域（aa 137-379）R232突变型，是最普遍的人源STING蛋白的同型。这个27kDa的重组蛋白产生自哺乳动物中国仓鼠卵巢细胞系（CHO），通过亲和层析纯化，不带标签，能够被市面上的商品化人源STING抗体所识别。

核酸转染试剂

LyoVec™

LyoVec™是第一个冻干的阳离子脂质体转染试剂。它由磷脂DTCPTA组成，后者可以与中性脂质体DiPPE偶联，增加双层膜结构的不稳定性，从而增加LyoVec™的体外转染效率。LyoVec™的正电荷能够使其与DNA结合，同时其磷脂结构能够促进DNA运输至与细胞膜融合。

LyoVec™，被开发为质粒DNA转染试剂，能够被有效地用于核酸络合试剂以促进基于RNA或DNA的寡聚核苷酸，如RIG-I配体，5’ppp-dsRNA和3p-hpRNA（参见第二页）或cGAS的配体，HSV60 and VACV70进入到胞内。这个络合步骤是通过模式识别受体引起对核酸反应至关重要的一步。

基因筛选抗生素
细胞培养测试的抗生素 
• 无菌 
• 无内毒素 
• 验证筛选功能

InvivoGen提供一系列细胞培养测试的抗生素以确保无假阴性筛选稳转哺乳动物细胞株。这些抗生素无菌且无内毒素污染以避免细菌内毒素，也被称为LPS，对转染细胞造成的有害影响。InvivoGen严格验证产品的物理化学，通过微生物和细胞培养以确保其功能活性。所有出品的抗生素被证实对哺乳动物细胞表现出长期的稳定性并且没有细胞毒性。

InvivoGen的筛选抗生素可与其他筛选抗生素或与细胞培养过程中预防支原体，细菌，真菌污染的抗微生物抗生素联合使用。有不同的规格可供选择。


相关产品