深圳欣博盛生物科技有限公司

随温度升高水凝胶将会变硬。

0℃-15℃：溶胶

15℃-20℃：溶胶和凝胶的中间体

20℃：相态变化的温度转折点

20℃以上：水凝胶

37℃以上：随温度升高，水凝胶开始变硬。

● 在培养基中加入5%的NaOH（氢氧化钠）和0.1%的NaClO（次氯酸钠）。

● 在室温放置5-10分钟。

该操作能有效地使培养基中的所有抗生素失效。

2 细胞培养过程中所使用的培养基或添加的培养物均要确保无菌无污染。

3 定期使用显微镜或检测试剂盒监测细胞培养基，以确保无微生物污染。

4 使用抗污染抗生素。在原代细胞培养或克隆过程中微生物污染是难以发现的，Invivogen公司为此设计了具有预防功能的防污染试剂。Invivogen公司可提供的抗污染抗生素有Plasmocin™ prophylactic，Normocin™， Primocin™ 及Fungin™。

● 对于前2-3次传代的细胞，应置于含20%胎牛血清且无抗生素的培养基中培养。但此条件下培养细胞时间不宜过长，2-3代之后的细胞应使用含10%胎牛血清的培养基进行培养。

● 请定期检查细胞状态，不要使细胞的汇合度达到100%。

● 当冻存细胞时，请继续培养其他未冻存的细胞，以防冻存细胞有问题。

如果你正在培养THP1细胞，以下是额外需要注意的地方：

● 对于THP1细胞，我们建议细胞浓度在3 x 105 -7 x 105 cells/mL时进行传代，一般为5 x 105 cells/mL。如果低于这个浓度，细胞将需要很长时间才能生长，如果高于2 x 106 cells/mL，则可能会产生毒性。

● 在每次传代之间，请不要使用离心机分离细胞。THP1细胞在条件培养基中生长的会更好，因此当传代时，不要弃去上一代培养细胞时所使用的全部培养基，留1-2 mL，并加入新鲜的培养基。但是原来培养基的占比不能超过50%，因为这样会导致细胞无法获得足够的营养去生长。

由于最初的耐药标记物水平较低，细胞对筛选抗生素会更加敏感。因此，建议等待2 - 3代后再添加筛选抗生素，以避免在前几代时对细胞造成进一步的应激。

建议使用无内毒素的血清来培养报告细胞系。InvivoGen在培养细胞时，会要求供应商提供其所使用血清的COA，以确保低水平的内毒素，以免激活NF-kB通路。

没有问题的，只要培养基中L-谷氨酰胺的浓度不低于2 mM就可以。大多数DMEM配方中含有4mM的L-谷氨酰胺，但一般情况下培养基中含有2 mM的L-谷氨酰胺即可维持细胞的正常生长。

谷氨酰胺或谷氨酰胺衍生物GlutaMax均已通过测试，可以使用，在使用过程中与添加L-谷氨酰胺的细胞相比未发现有任何差异。

许多InvivoGen的细胞系都是通过SEAP（分泌型胚胎碱性磷酸酶）报告系统进行改造的。在很多情况下胎牛血清（FBS）中含有的微量碱性磷酸酶（AP）会干扰检测结果。因此，为了降低背景干扰，建议使用灭活血清培养Invivogen的所有细胞。

拿到重组人IL-4的说明书后，您会发现有一段关于Reconstitution（重悬）的叙述，这段内容含有溶解相关的所有信息。

1. Centrifuge the vial prior to opening

第 1 步：开盖前离心试剂管

PeproTech 的细胞因子或蛋白冻干粉装盛在塑料管中，为无菌包装。冻干粉在运输过程中可能会因颠簸而漂散并粘贴于管壁或管盖上，所以在打开塑料瓶盖前，需将冻干粉通过离心收集到管底，以便用很小体积的液体即可将冻干粉完全溶解。

答：有些小型高速离心机（多为进口品牌）的面板上有一个 Spin 键，按了此键后，离心机会自动快速上升到其最大速度(10000rpm 或 12000rpm)，上升到最高点后速度即刻下降，直至停止旋转，整个过程大约 30s。这个 Spin 键足以很好的将细胞因子或蛋白收集到管底。

但有些实验室没有这样的高速离心机，只有最高转速为 4000-4500rpm 的离心机。这种情况下，需 3000-3500rpm 离心 5min，也能达到类似的效果。

2. Reconstitute in water to a concentration of 0.1-1.0 mg/ml. Do not vortex.

第 2 步：用无菌水重悬至 0.1-1.0 mg/ml ，不可振荡。

这个步骤即为溶解步骤，非常重要。

1）一定要用推荐的溶液重悬（或溶解）冻干粉

用于溶解细胞因子或蛋白的溶液千差万别。此例中的重组人 IL-4 需用水溶解，而重组人 IL-2 （产品编号：200-02）则需用 100mM Acetic Acid （醋酸）溶解，重组人TGF-beta1 （产品编号：100-21）需用 10mMCitric Acid（柠檬酸），pH3.0 溶解，重组人FGF-basic（产品编号：100-18B）需用 5mMTris，pH7.6 溶解，重组人FGF-10（产品编号：100-26）需用5mMSodium Phosphate（磷酸钠），pH7.4 溶解，重组IL-13（产品编号：200-13）需用 20mMMHCl溶解。（注：即使同一重组细胞 因子或蛋白，不同批次的溶解方法也可能有所不同，因此上面的叙述仅供参考。 具体应该如何溶解应以相应批次的官方说明书为准）。

2）一定要溶解到指定的浓度。

蛋白在一定的浓度范围内可以保持良好的稳定性，这个范围就是说明书上所标明的浓度范围，该例为 0.1-1.0 mg/ml。这个浓度范围对于不同的细胞因子或重组蛋白是不同的。如重组人FGF-6（产品编号：100-30）为 0.5-1.0mg/ml，而重组人Activin B（产品编号：120-15）则一定要是0.5mg/ml。

3）一定不能振荡(vortex)。

这里所说的振荡是指用涡旋仪进行快速振荡。

The solution can be stored at 2-8℃ for up to one week.

第3步：该重悬液在2-8℃最长可保存1周。

用说明书上推荐的溶液重悬细胞因子或重组蛋白至推荐的浓度后，可置于2-8℃储存，在此条件下其活性最长可保持1周。这对于周期为5-7天的实验，如DC（树突状细胞）的诱导成熟是足够的。在此期间，只要每次从冰箱里吸取一定量的细胞因子或重组蛋白重悬液加入到培养体系即可。一般说明书上推荐的重悬浓度要高于实验时使用的浓度，此时可能需要对重悬后的溶液进行稀释。如需进行稀释，必须遵循第4步中的方法要求，使用含载体蛋白的溶液进行稀释。否则稀释后的细胞因子或重组蛋白很容易粘附在管壁或瓶壁上，使得溶液中细胞因子的或重组蛋白的浓度下降，总的蛋白活性大为减弱。

For extended storage, it is recommended to further dilute in a buffer containing a carrier protein(example 0.1% BSA) and store in working aliquots at -20℃ to -80℃。

第4步：如果要长期保存，需使用含载体蛋白（如0.1% BSA，或10% FBS，或5% HSA）的溶液进一步稀释，然后分装冻存于-20℃至-80℃。

如果实验周期长于一周，或配制的细胞因子或蛋白一次用不完，则需对细胞因子或重组蛋白进行长期保存。方法：将已重悬的细胞因子或蛋白用含载体蛋白，如0.1% BSA（牛血清蛋白），10% FBS（胎牛血清），5% HSA（人血清白蛋白）的溶液进一步稀释，然后分装冻存于-20℃至-80℃。

经常有客户使用COA上推荐的溶液重悬细胞因子或重组蛋白冻干粉后不使用含载体蛋白的

载体蛋白，如0.1% BSA（牛血清蛋白），10% FBS（胎牛血清），5% HSA（人血清白蛋白）的主要作用是预先封闭塑料管壁上的蛋白结合位点，使细胞因子或重组蛋白不会粘附于管壁。如果在细胞因子或重组蛋白冻干粉用推荐的溶液重悬后不用含载体蛋白的溶液进一步稀释，而直接分装冻存，则溶液中的大部分细胞因子或重组蛋白均会粘附到管壁上，导致溶液中实际溶解的细胞因子或重组蛋白浓度大为降低，最终表现为细胞因子或重组蛋白活性下降。因此，在分装冻存时，一定要用含载体蛋白的溶液将重悬液进一步稀释。稀释后的细胞因子或重组蛋白可为任意浓度，因为大量的载体蛋白可以保证任意浓度细胞因子或重组蛋白仍然维持较高的稳定性。一般情况下，推荐的稀释倍数是原重悬浓度的5-10倍，稀释后的细胞因子或重组蛋白的浓度不低于10 ug/ml。

还有一个经常被问及的问题，即在做无血清培养或动物体内实验时，细胞因子中不能含有

重悬后的细胞因子或重组蛋白，在4℃条件下可短期储存1-2周左右的时间，具体请参考具体产品的COA。若要长期储存，需使用含载体蛋白的溶液稀释已重悬的细胞因子或蛋白，分装后请置于-20℃或-80℃储存。为避免蛋白部分变性，在冻存期间请避免重复冻融循环。

PeproTech大部分无动物成分级别细胞因子的内毒素水平均保证低于0.01 ng/µg蛋白，即0.1 EU/µg蛋白。对于大多数非无动物成分级别的细胞因子，内毒素水平保证低于0.1 ng/µg蛋白，即1 EU/µg。事实上许多细胞因子的实际内毒素含量均低于说明书上标注的内毒素水平。

国际单位(IU)是与国际标准品的活性单位(即IU/ng)比对后得出的活性数值，后者是在世界卫生组织(WHO)领导的国际合作研究中确定的。WHO国际标准品由英国国家生物制品检定所(NIBSC)制备和提供。

简单地与国际标准品比对而得出的蛋白活性国际单位(IU)常会出现偏差，原因是每个蛋白厂家所用的活性检测方法很难一致，从而导致与国际标准品比对后得到的国际单位(IU)值相互间不具可比性。想要实现真正的可比性，必须建立标准的活性检测方法，以保证所得出的蛋白活性国际单位(IU)值仅与蛋白的质量有关，而与蛋白的来源无关。

在可能的情况下，PeproTech通过将自己的产品与对应的WHO标准品在自已的生物活性测试中进行多次平行比对来得出国际单位(IU)值。多次对比可保证我们能够排除因测试本身的不稳定性(如产品批次，使用方法和测试方案等的变异性)而导致的异常值的出现。经多次比对得出的结果可对我们产品的国际单位(IU)值进行可靠的定量。

与市场上的许多蛋白产品不同，PeproTech的产品中不含任何载体蛋白和其它添加物（如BSA, HSA和蔗糖等），并且常在最低含盐量的溶液中冻干，结果是微量的蛋白在冻干过程中会沉积在管壁上，形成蛋白薄膜，有时肉眼观察不到。建议在打开管盖前用小离心机快速离心20-30秒，使附着在管盖或管壁上的蛋白聚集于管底。尽管可能看不到蛋白团块，但Peprotech的质控程序保证每管中的蛋白含量准确无误。

请将抗体置于4℃避光储存。即使分装后，也不推荐将抗体冷冻储存，因为冻融循环会导致抗体活性降低。一般来说，蛋白在高浓度条件下储存不易降解，因此应避免将抗体稀释至工作浓度后在4℃条件下储存超过一天，即应现用现配。按要求储存且保证抗体无菌，抗体活性可保持长达一年甚至更长时间。

答：由于找到合适免疫测定的匹配抗体需要大量的时间和精力，所以我们不能提供制作试剂盒所用抗体的详细信息。

答：某些ELISA试剂盒内的预处理液是为了将目标蛋白与其他可能的相关结合蛋白分离开。

答：ELISA 试剂盒灵敏度计算方法如下： {2(空白对照标准差) (空白对照以上的最低标准品浓度平均值)} / (空白对照以上最低标准品OD值的平均值—空白对照OD值的平均值). 需要10-20 个样品完成这个计算 。

答：试剂盒的定量极限等于标准曲线中用的最低蛋白浓度。