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Invivogen基因筛选抗生素常见问题

2021-06-10
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▶ 基因筛选抗生素常见问题

多种筛选抗生素可以用于同一细胞系吗?

可以的,所有的筛选抗生素均可同时或任意组合使用。


为什么在初始细胞培养的过程中不推荐使用筛选抗生素?

我们建议在细胞传代两次之前不要添加筛选抗生素,因为细胞在初始培养过程中是脆弱的,抗生素可能会降低细胞活力。并且耐药标记的充分表达使细胞获得对这些筛选抗生素的耐药性是非常重要的。


如何停用Invivogen的筛选抗生素?

对于停用Invivogen所有的筛选抗生素(Zeocin™, Hygromycin, G418, Phleomycin, Puromycin, and Blasticidin),建议如下:

● 在培养基中加入5%的NaOH(氢氧化钠)和0.1%的NaClO(次氯酸钠)。

● 在室温放置5-10分钟。

该操作能有效地使培养基中的所有抗生素失效。


可以提供Invivogen筛选抗生素在细胞培养基中的半衰期数据吗?

非常抱歉,Invivogen没有关于筛选抗生素在细胞培养中的半衰期数据。Invivogen在测试时是在新鲜培养,而非储备培养基中添加筛选抗生素的。但是如果有需要的话,可以在培养基中补充筛选抗生素,并储存于4℃,储存时间不超过一周。


应该如何储存Invivogen的筛选抗生素?

Invivogen所有的筛选抗生素均在室温下运输,收到之后,可置于4℃短期储存,若要长期储存需置于-20℃。避免重复冻融循环。有效期在产品标签上。

开封之后,在-20℃下可稳定一年时间,但需避免冻融循环。在4℃无菌条件下可稳定3个月的时间。


Invivogen各类筛选抗生素的特性。

产品名称性质浓度工作浓度拆封后稳定性抗性基因
潮霉素BHygromycin B Gold氨基糖苷类抗生素100mg/mLCells: 50-200 ug/mL
E.coil: 50-100 ug/mL
>1year at -20
>1year at 4
hph
博莱霉素(Zeocin™獒合钢糖肽类抗生素100mg/mLCells: 50-400 ug/mL
E.coil: 25 ug/mL
注:请不要使用含Tn5转座因子的大肠杆菌菌株,如MC1066。因为Tn5编码博莱霉素抗性基因,使大肠杆菌菌株对博莱霉素产生抗性。
Powder:
>1 year at -20
1 year at 4

Solution:
1 year at -20

3 months at 4
Sh ble
腐草霉素(Phleomycin糖肽类抗生素20mg/mLCells: 5-50 ug/mL
E.coil: 5 ug/mL
注:一般大肠杆菌受体菌株(如HB101DH5αMC1061)与携带博莱霉素耐药基因(如Sh ble Tn5)的载体转化可对腐草霉素产生抗性
Powder:
>1 year at -20
1 year at 4

Solution:
1 year at -20

3 months at 4
Sh ble
G418遗传霉素(G418Geneticin氨基糖苷类抗生素100mg/mLCell: 100 ug/mL- 1 mg/mL(常用浓度为400 ug/mL
注:G418遗传霉素只能用于筛选和维护表达Neo基因的哺乳动物细胞
1year at -20
3 months at 4
neo
嘌呤霉素(Puromycin氨基糖苷类抗生素10mg/mLCell: 1-10 ug/mL
:嘌呤霉素能迅速杀死不含pac基因的真核细胞
E.coil: Puromycin
(嘌呤霉素)对大肠杆菌具有很低的活性,但是当低盐LB培养基的pH7.5-8之间时,可使用100-125 ug/mLPuromycin(嘌呤霉素)筛选耐嘌呤霉素转化菌株
1year at -20
3 months at 4
Pac
杀稻瘟菌素(Blasticidin核苷类抗生素10mg/mLCell: 1-10 ug/mL
E.coil: 100 ug/Ml(低盐LB培养基的pH8时的使用浓度)
1year at -20
3 months at 4

注:对于粉末状的杀稻瘟菌素,若重悬之后储存浓度必须大于或等于10 mg/mL才可在-20℃的条件下稳定1年,若浓度低于10 mg/Ml,则无法保证该产品的稳定性。
bsr


▶ Hygromycin B Gold(潮霉素B)

技术资料中只有Hygromycin B Gold(潮霉素B)在低盐LB培养基中推荐的使用浓度为50-100 ug/ml,但是实验室中只有高盐的LB培培养基,那应该使用多少浓度的Hygromycin B Gold(潮霉素B)呢?

Invivogen推荐在高盐LB的培养基中使用100 – 150 µg/mL的Hygromycin B Gold(潮霉素B)。


Hygromycin B Gold(潮霉素B)用于哺乳动物细胞时,应使用什么浓度?

Hygromycin B Gold(潮霉素B)用于哺乳动物细胞时推荐的使用浓度为50-200 ug/ml,也有少数参考文献中提到的使用浓度高达500 ug/ml。建议在正式实验开始前,先确定可杀死宿主细胞系所需要的Hygromycin B Gold(潮霉素B)的最佳浓度。Hygromycin B Gold(潮霉素B)的常用剂量为200 ug/ml,即将原液稀释500倍。关于更多的细节信息,请参考该产品的说明书。


Hygromycin B Gold(潮霉素B)用于大肠杆菌时,应使用什么浓度?

在低盐LB培养基中推荐使用50-100 ug/ml的Hygromycin B Gold(潮霉素B)筛选耐潮霉素转化菌株。含有Hygromycin B Gold(潮霉素B)的平板培养基可在4℃下稳定1个月。


▶ Zeocin™(博莱霉素)

Invivogen提供的Zeocin™(博莱霉素)是硫酸的还是盐酸的?

Invivogen提供的是硫酸Zeocin™(博莱霉素)。


Zeocin™(博莱霉素)是光敏的吗?

不是的,Zeocin™(博莱霉素)不是光敏的。


Zeocin™(博莱霉素)对pH敏感吗?

是的,Zeocin™(博莱霉素)对pHshiite敏感的,其在低pH值和高pH值(<6和>8)或弱氧化剂存在下会发生不可逆变性。


Zeocin™(博莱霉素)稀释至工作浓度,推荐使用什么缓冲液?

Zeocin™(博莱霉素)稀释至工作浓度时推荐使用无菌水。


推荐使用什么浓度的HEPES缓冲液去重悬Zeocin™(博莱霉素)?

用于重悬Zeocin™(博莱霉素)的HEPES缓冲液浓度为5 g/L.


Zeocin™(博莱霉素)应如何储存?

Zeocin™(博莱霉素)在室温条件下运输,收到之后,可置于4℃短期储存,若要长期储存请置于-20℃。

避免重复冻融循环,有效期在产品标签上。

对于粉末状的Zeocin™(博莱霉素),一旦重悬至100 mg/mL,可在4℃条件下储存12个月,在-20℃条件下储存18个月。

对于溶液状的Zeocin™(博莱霉素),开封后,可在-20℃下可稳定一年时间,但需避免冻融循环。在4℃下可稳定3个月的时间,但需置于无菌条件。


Zeocin™(博莱霉素)用于哺乳动物细胞时,应使用什么浓度?

Zeocin™(博莱霉素)用于哺乳动物细胞系时推荐的使用浓度为50-400 ug/ml,也有少数参考文献中提到的使用浓度低至20 ug/mL,或高至1000 ug/mL。建议在正式实验开始前,先确定可杀死宿主细胞系所需要的Zeocin™(博莱霉素)的最佳浓度。关于更多的细节信息,请参考该产品的说明书。


Zeocin™(博莱霉素)用于大肠杆菌时,应使用什么浓度?

在低盐LB培养基中推荐使用25 ug/mL的Zeocin™(博莱霉素)筛选耐博莱霉素转化菌株。

注意:不要使用含Tn5转座因子的大肠杆菌菌株,如MC1066。因为Tn5编码博莱霉素抗性基因,是大肠杆菌菌株对Zeocin™(博莱霉素)产生抗性。


▶ Phleomycin(腐草霉素)

Phleomycin(腐草霉素)应如何储存?

Phleomycin(腐草霉素)室温条件下运输,收到之后,可置于4℃短期储存,若要长期储存请置于-20℃。

避免重复冻融循环,有效期在产品标签上。

对于粉末状的Phleomycin(腐草霉素),一旦重悬至20 mg/mL,可在4℃条件下储存12个月,在-20℃条件下储存18个月。

对于溶液状的Phleomycin(腐草霉素),开封后,可在-20℃下可稳定一年时间,但需避免冻融循环。在4℃下可稳定3个月的时间,但需置于无菌条件。


Phleomycin(腐草霉素)用于哺乳动物细胞时,应使用什么浓度?

Phleomycin(腐草霉素)用于哺乳动物细胞系时推荐的使用浓度为5-50 ug/ml。建议在正式实验开始前,先确定可杀死宿主细胞系所需要的Phleomycin(腐草霉素)的最佳浓度。关于更多的细节信息,请参考该产品的说明书。


Phleomycin(腐草霉素)用于大肠杆菌时,应使用什么浓度?

在低盐LB培养基中推荐使用5 ug/mL的Phleomycin(腐草霉素)筛选耐腐草霉素转化菌株。

注意:一般大肠杆菌受体菌株(如HB101、DH5α、MC1061)与携带博莱霉素耐药基因(如Sh ble、 Tn5)的载体转化可对Phleomycin(腐草霉素)产生抗性。


▶ G418(遗传霉素)

同时购买的两瓶G418遗传霉素均置于-20℃储存,为什么其中一瓶会凝结成固体,而另外一瓶则是完全透明的液体?

Invivogen实验室也有注意到同样的现象。由于液体的结冰反应需要扰动才可以进行,所以即使在0℃以下,溶液的结冰反应也不可自发进行。这种扰动可以是震动、冲击等。因此不同管G418凝固的差异可以解释为对其中一管的G418有一个小的冲击或震动,而未碰触到其他管。

注意,液体中的凝固反应是一个连锁反应,一旦发生便可迅速扩散到整个可用的溶液。


应如何让储存G418?

G418在室温下运输。收到之后,请置于4℃短期储存,若要长期储存请置于-20℃。避免重复冻融循环,有效期在产品标签上。

一旦拆封,-20℃条件下储存可稳定一年,期间需避免重复冻融循环。4℃无菌条件下储存可稳定3个月。


将G418用于哺乳动物细胞时,应使用什么浓度?

G418用于筛选和维护转染neo基因的哺乳动物细胞系的工作浓度取决于多种因素,例如细胞类型。因此,我们建议正式实验开始之前使用不同浓度的抗生素(例如100 ug/mL- 1 mg/mL)处理细胞,以确定杀死宿主细胞系所需的最佳抗生素浓度。请注意:G418常用剂量为400 ug/mL。


是否可以使用G418在大肠杆菌中筛选含有Neo基因的质粒?

不可以的。G418只能在表达Neo基因的哺乳动物细胞中使用。对筛选表达Neo基因的大肠杆菌转化子建议使用 Kanamycin(卡那霉素)。


▶ Puromycin(嘌呤霉素)

应使用什么缓冲液重悬Puromycin(嘌呤霉素)?

Invivogen推荐使用HEPES缓冲液 (5 mM, pH 7.3)重悬Puromycin(嘌呤霉素)。


Puromycin(嘌呤霉素)置于-20℃储存时出现结晶固体,是否正常?

是正常的,在储存过程中可能会形成Puromycin(嘌呤霉素)的结晶沉淀。如果发生此情况,请将产品置于37℃下加热30分钟,直到结晶沉淀消失。结晶沉淀的形成并不影响产品的活性。


应如何储存Puromycin(嘌呤霉素)?

Puromycin(嘌呤霉素)在室温下运输。收到之后,可置于4℃短期储存,若要长期储存请置于-20℃。避免重复冻融循环,有效期在产品标签上。

一旦拆封,-20℃条件下储存可稳定一年,期间需避免重复冻融循环。4℃无菌条件下储存可稳定3个月。


Puromycin(嘌呤霉素)用于哺乳动物细胞时,应使用什么浓度?

Puromycin(嘌呤霉素)用于筛选哺乳动物细胞系的工作浓度为1-10 ug/mL。我们建议正式实验开始之前使用不同浓度的抗生素处理细胞,以确定杀死宿主细胞系所需的最佳抗生素浓度。请注意:Puromycin(嘌呤霉素)能迅速杀死不含pac基因的真核细胞。更多的细节信息,请参考本产品说明书。


Puromycin(嘌呤霉素)用于大肠杆菌时,应使用什么浓度?

Puromycin(嘌呤霉素)对大肠杆菌具有很低的活性,但是当低盐LB培养基的pH在7.5-8之间时,可使用100-125 ug/mL的Puromycin(嘌呤霉素)筛选耐嘌呤霉素转化菌株。


▶ Blasticidin(杀稻瘟菌素)

应如何储存Blasticidin(杀稻瘟菌素)?

Blasticidin(杀稻瘟菌素)在室温下运输。收到之后,可置于4℃短期储存,若要长期储存请置于-20℃。避免重复冻融循环,有效期在产品标签上。

一旦拆封,-20℃条件下储存可稳定一年,期间需避免重复冻融循环。4℃无菌条件下储存可稳定3个月。

注意:对于粉末状的Blasticidin(杀稻瘟菌素),若重悬之后储存,其浓度必须大于或等于10 mg/mL才可在-20℃的条件下稳定1年,需注意避免重复冻融循环。如果储存时浓度低于10 mg/mL,则无法保证该产品的稳定性。


Blasticidin(杀稻瘟菌素)用于哺乳动物细胞时,应使用什么浓度?

Blasticidin(杀稻瘟菌素)用于筛选哺乳动物细胞系的工作浓度为1-10 ug/mL,也有少数参考文献中的使用浓度高达30 ug/mL。我们建议正式实验开始之前使用不同浓度的抗生素处理细胞,以确定杀死宿主细胞系所需的最佳抗生素浓度。更多的细节信息,请参考本产品说明书。


Blasticidin(杀稻瘟菌素)用于大肠杆菌时,应使用什么浓度?

Blasticidin(杀稻瘟菌素)对大肠杆菌具有很低的活性,但是当低盐LB培养基的pH为8时,可使用100 ug/mL的Blasticidin(杀稻瘟菌素)筛选耐杀稻瘟菌素转化菌株。注意:高pH值可提高杀稻瘟菌素的活性。




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