深圳欣博盛生物科技有限公司

背景有黑点，怎么办？  详情信息

1、封闭液未溶完全

解决：

A.    确认BSA/牛奶有完全溶解，建议增加溶解时间或溶解后取上清液使用。

B.    利用0.45um滤纸过滤溶液，也可使用商品化试剂，如GTX30964（Trident Universal Protein Blocking Reagent，适用于WB、IHC、ICC/IF、ELISA）。

C.    改变缓冲液，如换为BSA。

2、溶液污染

解决：

使用现配的溶液（Running/transfer/blocking/wash buffers）或商业化溶液减少因长菌长霉造成的黑点。

3、封闭液及抗体交互作用

解决：

一般脱脂牛奶中含有casein这种磷酸蛋白，可能会与磷酸化抗体产生非特异性结合。因此，如使用磷酸化抗体，建议用BSA作为封闭溶液，同时洗脱溶液也用TBST，如此可降低黑点高背景的情况。

过曝，怎么办？  详情信息

1、蛋白样品过量

解决：

降低蛋白上样量，通常蛋白上样量为30-50ug，但有些蛋白表达量较高（如β-actin），此时可依蛋白表达量，进行微调。

2、抗体过量

解决：

A. 增加抗体稀释倍数。

B. 减少孵育时间，一般孵育时间为37℃，1小时。

C. 于4℃过夜孵育，减少抗体非特异性结合。

3、讯号过曝

解决：

A. 缩短曝光时间。

B. 使用低灵敏的ECL。

拖带，怎么办？  详情信息

1、样品不纯，有杂质污染

解决：

A. 重新离心样品，取上清液使用。

B. 使用较纯的试剂配制细胞裂解液或购买商业化产品。

C. 使用Benzonase®核酸酶，Benzonase®核酸酶能迅速水解核酸，降低蛋白样品粘度，减少核酸对跑胶的干扰。

D. 全细胞或亚细胞萃取，使用商业化全细胞或亚细胞萃取试剂盒提取蛋白样品，减少配制试剂溶液以及操作中分离不干净的问题。

2、蛋白样品过量

解决：

A. 降低蛋白上样量，通常蛋白上样量为30-50ug，但有些蛋白表达量较高(如beta actin)，此时可依蛋白表达量，进行微调。

B. 蛋白变性不完全，也会使条带成团拖曳；此时，可通过延长样品加热时间(一般约5分钟)及调整SDS(一般是2 %)比例，使蛋白变性更完全。

3、讯号过曝

解决：

A. 缩短曝光时间。

B. 使用低灵敏的ECL。

条带扭曲，怎么办？  详情信息

1、胶没配好

解决：

A. 确保APS＆TEMED正常，并新鲜配制胶体。

B. 空的泳道加Sample Buffer

2、电流电压问题

解决：

避免胶体过热。电压过高也会出现微笑、歪斜条带等条带，建议上层浓缩胶使用80V；下层分离胶使用100-120V。另外也需检查电泳槽是否有锈蚀造成电流不稳。过热时可改为在冷室或者冰浴中进行电泳。

3、转膜问题

解决：

小心滚压胶体并确保与膜贴合，有时出现 2个条带是因为转膜时不小心移动到膜产生叠影。

高背景，怎么办？  详情信息

1、封闭问题

解决：

A. 确认封闭完全。封闭作用不足，这是其中一种可能的原因，提高封闭物浓度可确保封闭液完全覆盖转印膜，如使用5% 脱脂奶粉或BSA。

B. 封闭液不与抗体反应。这种情况较常发生在磷酸化抗体的使用过程中，由于牛奶含有casein这种磷酸蛋白，因此如果使用牛奶当封闭液，封闭液与磷酸化抗体可能会产生非特异性的结合。这个情况下，建议使用BSA作为封闭液，同时搭配使用TBST的洗脱液来帮助降低高背景值的状况。

C. 封闭时间增加，一般情况会使用室温37度封闭1小时，可视情况调整封闭的条件。

2、膜的问题

解决：

A. 选择合适的膜（可参考详情信息）

B. 膜干掉，建议整个实验过程都须注意让膜保持湿润，特别是PVDF膜。

C. 膜没有完全均匀湿透，PVDF膜较会出现这个状况，使用PVDF膜前，需用100% methanol完全浸润膜。

3、抗体问题

解决：

A. 降低抗体浓度

B. 以阳性对照确认二抗

C. 足够的洗脱时间和次数

4、呈色问题

解决：

ECL呈色问题造成高背景值的原因，可能是因为化学显色底物过多；建议按说明书加入适量的显色底物。

非特异性条带，怎么办？  详情信息

1、蛋白降解

解决：

A. 加蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂，避免蛋白降解。

B. 冰上操作。

C. 避免反复冻融样品（建议分装）；建议使用新鲜制备的样品。

2、蛋白形成多聚体

解决：

A. 使用现配的DTT/2-ME并将加热时间延长，帮助打断多聚体的双硫键。

B. 样本煮沸温度达到95℃-100℃。

3、确认蛋白特性

解决：

查询生物信息是否有后修饰、剪切体等。

4、抗体浓度过高/蛋白样品过量

解决：

A. 增加抗体稀释倍数，也可调整孵育时间，并在4℃孵育。

B. 减少上样量。

5、抗体非特异性结合

解决：

A. 增加洗膜次数与时间或在洗涤液里改用不同强度的detergent或是增加浓度。

B. 设对照组来确认抗体非专一性结合可能的原因，例如：是否有目标蛋白表达。

6、抗体检测到heavy/light chain的信号

解决：

这种情况通常发生在IP实验里，GeneTex有一系列可避免辨认heavy/light chain的特制二抗，其设计原理是用来辨认native的一抗结构。（可参考详情信息）

更多详情请咨询Genetex中国独家代理商-欣博盛生物

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