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PUREfrex^® - 无细胞蛋白合成系统

PUREfrex^®是在东京大学上田卓也（Takuya Ueda）教授发明的 PURE系统技术基础上，全新开发的“重构型、无细胞蛋白合成系统”。其核心思路是把大肠杆菌转录-翻译所需的全部组分纯化后再按精确比例重新组装。

● 什么是PURE？

PURE(Protein synthesis Using Recombinant Elements)系统技术是由东京大学的Takuya Ueda教授发明的一种重构型、无细胞蛋白质合成系统。

该反应系统仅由蛋白质、核糖体、氨基酸和NTPs组成。这些蛋白质是转录、翻译、氨酰化和能量再生所必需的。所有的蛋白因子和核糖体均经过高度纯化，并在缓冲液中与氨基酸、NTPs和tRNAs等底物组装在一起。翻译因子包括: 起始因子IF1/IF2/IF3，延伸因子EF-Tu/EF-Ts/EF-G，释放因子RF1/RF2/RF3，核糖体再循环因子(RRF)，20种氨酰tRNA合成酶(ARS)，甲硫氨酰tRNA转移酶。

图1. PURE(Protein synthesis Using Recombinant Elements)系统技术示意图

该系统是一种仅包含转录和翻译组分的反应体系，不像其他使用细胞裂解物的无细胞蛋白质合成系统。该系统没有未知蛋白质，其组分可根据需要自由调整。

● 什么是PUREfrex？

PUREfrex^®是基于的PURE系统技术而开发的一系列重构型、无细胞蛋白质合成试剂。该系统最重要的特点是其“重建（reconstitute）”性质，即仅集合了与转录和翻译相关的因子。这一独特性质使用户能够自由调整反应体系的组成成分。此外，由于系统仅包含已知的蛋白质和底物，因此在蛋白质合成后进行的后续检测中，无需担心严重的背景干扰问题。

PUREfrex^® 系统的核心组分，采用精简的“四组分”设计，以便于用户操作：

• Solution I：所有非蛋白类组分的混合物，包含氨基酸、NTPs、其他小分子化合物和tRNAs

• Solution II：经纯化的蛋白类组分混合物，包含RNA聚合酶、翻译因子和其他蛋白质

• Solution III：纯化的核糖体

• Control Template：已验证可用于该系统的 DNA 模板

客户只需将编码目标蛋白质的DNA(或mRNA)加入到溶液I、II和III的混合物中，然后在特定条件下孵育反应混合物，即可得到目标蛋白。亦可根据需求添加其他相关试剂，具体可参考后文。

相对于PURE系统，PUREfrex^® 试剂盒中各组分都在纯化工艺上进行了改进，不仅大幅降低了 RNase 和 β-半乳糖苷酶的残留，还将脂多糖（LPS）控制在每 1 µL 反应液低于 1 EU。而且，PUREfrex试剂中包含的所有翻译因子和其他蛋白质不包含任何标签序列。这使用户可以使用任何标签序列来纯化和检测合成的蛋白质。

图2. PUREfrex与原始PURE系统中污染物比较

PUREfrex^®试剂盒目前有3个系列：PUREfrex^®1.0；PUREfrex^®2.0；PUREfrex^®2.1。

• PUREfrex^®1.0

2011年推出，反应溶液的成分信息是公开的，适用于产品定制等需要明确组成成分信息的研究。虽然使用 PUREfrex^® 2.0 合成蛋白时的速度较快，但可能会因无法及时形成和折叠二硫键等导致不溶，此时使用合成速度较慢的PUREfrex^® 1.0 效果可能更好。

• PUREfrex^®2.0

2015年推出，PUREfrex^® 2.0改进了从大肠杆菌中纯化的所有组分的制备方法，并优化了因子的组成，使PUREfrex 2.0实现了比PUREfrex 1.0高2-10倍的蛋白质生产率。适用于需要合成大量蛋白及多种蛋白的研究。反应液成分信息保密。

• PUREfrex^®2.1

于2017年推出，在保留PUREfrex^® 2.0 反应液组成的基础上，单独添加了还原剂，因此可根据添加的还原剂（和氧化剂）种类和数量来调整合成过程中的氧化还原状态。适用于需严格控制氧化还原状态的含二硫键结合的蛋白合成。

图3.PUREfrex^® 1.0和PUREfrex^® 2.0对比数据

图4.PUREfrex^®2.0和PUREfrex^®2.1成分对比

● 产品信息

● 应用

使用PUREfrex^®可合成各种活性蛋白，包括原核蛋白、真核蛋白、膜蛋白、含二硫键的蛋白质、含非天然氨基酸的蛋白质。PUREfrex^®可用于以下研究领域，适用于各种蛋白质的小规模、高通量合成，也是蛋白质功能评估的机器学习平台的理想选择。

1. 核糖体展示技术

2. mRNA展示技术

3. 蛋白翻译机制研究

4. 蛋白质合成后的折叠

● 蛋白合成添加剂

根据您的蛋白质的性质，可以选择不同的添加剂，添加到PUREfrex^®试剂盒中，改善蛋白的折叠和溶解性。 

1.分子伴侣

分子伴侣像hsp70（如E. coli DnaK）有助于合成蛋白质的正确折叠。由于PUREfrex^®试剂盒不含任何分子伴侣，一些蛋白质可能难以形成正确的构象，合成后为不溶性。在这种情况下，添加分子伴侣可能有助于增加溶解性和活性。

2.形成二硫键

对于某些蛋白质，如分泌蛋白，二硫键的形成对其稳定性或活性很重要。二硫键通常是由相邻半胱氨酸残基的巯基（SH-）氧化形成的。因此，氧化环境是形成二硫键所必需的。此外，二硫键异构酶（如E. coli DsbC）可以催化二硫键交换，也是形成半胱氨酸正确配对所必需的。

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