IHC实验高效秘籍之—如何制备高质量样本？
你是否经历过这样的至暗时刻? 显微镜下，背景着色比目标抗原还深，非特异性染色如满天星斗；又或者，心心念念的目标抗原似乎“凭空消失”了，只留下一片苍白的背景。明明使用了相同的抗体、遵循了相同的实验步骤，得到的结果却天差地别。如果你也曾有过这样的困扰，那么问题或许既不在抗体，也不在于实验操作，而是出在最初、也最容易被忽视的一步：样本制备。
Vectorlabs 作为免疫组化、免疫荧光试剂领域的领导者，在本文中系统梳理了一套具备高重复性的IHC样本制备完整流程。
免疫组化(IHC)样本制备流程包括：样本固定、切片、脱蜡复水、抗原修复以及免疫组化笔(PAP)的应用。
图1：样本制备流程。
A. 组织保存：石蜡包埋(FFPE)和冷冻保存；
B. 根据最终应用，组织块切成不同厚度的切片；
C. 在二甲苯、梯度酒精中进行脱蜡和水化；
D. 热诱导抗原修复；
E. PAP笔在组织切片周围画圈施加疏水屏障，将试剂限制在特定范围内。
*脱蜡和水化仅适用于FFPE组织切片；
**对于解剖后速冻的组织，可能不需要热诱导 抗原修复；无论后续选择石蜡包埋还是冷冻保存，经过福尔马林固定的标本进行抗原修复都能改善染色。
组织样本的长期保存主要分为2类：石蜡包埋和冷冻保存
石蜡包埋：➀.醛类固定; ➁.梯度酒精脱水; ➂.二甲苯透明; ➃.石蜡浸透。
经由福尔马林固定( 防止组织自溶和腐败；保存组织形态)；接着，固定的组织经过一系列从低浓度到高浓度的梯度酒精处理；然后，与有机溶剂(如二甲苯)孵育去除酒精；最后一步，使用温热的石蜡浸透组织，然后冷却硬化，形成福尔马林固定、石蜡包埋的蜡块(FFPE)。
冷冻保存：将生物样本在-20℃或-80℃下冷冻，是保存组织用于IHC应用的另一种选择。常规冷冻流程：新鲜组织在液氮、异戊烷或干冰中速冻，用OCT包埋，再用冷冻切片机切片。组织固定通常在切片后进行，固定剂可选择丙酮、甲醇、乙醇和甲醛等。
固定剂选择tips(左图) | 石蜡包埋和冷冻保存流程图(右图) |
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石蜡包埋和冷冻保存对比
石蜡包埋组织(FFPE) | 新鲜冷冻组织 | 福尔马林固定冷冻组织 | |
固定时机 | 包埋前 | 切片后 | 冷冻前 |
固定液 | 甲醛 | 丙酮、甲醇、乙醇等 | 甲醛 |
包埋/防冻保护 | 石蜡 | OCT | 冷冻前用防冻剂浸透 |
保存 | FFPE块：室温下数年 | 冷冻OCT块(未固定)：-80°C下约1年 | 若以漂浮切片形式保存，则浸于防冻剂 |
抗原性 | 可能被固定诱导的交联掩盖 | 保留抗原性，通常不需要抗原修复 | 可能被固定诱导的交联掩盖 |
切片厚度 | 可薄至1um | 6-10um | 6-20um |
形态学 | 保存完好 | 冰晶形成可能影响组织形态 | 保存完好 |
Tips：
快速冷冻样本是保持组织和细胞形态的关键。如果冷冻速度过慢，会导致大冰晶的形成，从而破坏形态结构。下面是两种快速冷冻样本的方法：
➀. 在一个盛有液氮的小型杜瓦瓶中，放入一个装有异戊烷的金属容器。用铝箔纸包裹组织，然后将其浸入冰冷的异戊烷中。
➁. 将干冰粉碎并放入一个小型聚苯乙烯泡沫盒(泡沫箱)中。将组织放入盒中，并用粉碎后的干冰将其覆盖。
组织经冷冻或石蜡包埋后，需分别使用冰冻切片机或石蜡切片机进行切片。切片的常规厚度需根据最终实验目的而定。FFPE蜡块和冷冻组织都适用于制备薄切片和厚切片；但在需要超薄切片(<6μm)的应用中，FFPE蜡块的切片效果通常优于冷冻组织。研究人员可针对不同实验目的尝试多种切片厚度，以确定最佳条件。
薄切片：需要高显微镜分辨率，且视野内仅需观察少量细胞时，薄切片是首选；
厚切片(>6μm)：研究脑组织3D形态或神经轴突通路时，可选择>6μm的厚切片；
超厚切片(20–40μm)：适合细胞体视学定量分析和漂浮切片实验；
注：较厚的切片可能需要在后续流程中进行更长时间的孵育；厚冷冻切片可在封闭步骤中加入去污剂以提高组织通透性。
切片完成后，载玻片需要在室温下自然晾干约24小时，或者在50-60℃的烘箱中烘干1小时，在烘箱中烘干时必须密切留意，因为在高温下长时间烤片可能会降低免疫原性。有些组织还可以放在50℃恒温烤片机上加热30-60分钟，这样可以避免样本从载玻片上脱落。使用化学粘附试剂(如VECTABOND® Reagent, Tissue Section Adhesion，货号SP-1800)，有助于组织在原位杂交、高温抗原修复等严苛条件下仍牢固附着在载玻片上。
FFPE样本切片后需进行脱蜡和水化。这个过程的顺序(图2)与石蜡浸透时的脱水步骤完全相反：
➀. 二甲苯脱蜡
➁. 梯度酒精复水
图2. 脱蜡、复水步骤简易图
脱蜡不彻底会导致同一样本中同一 抗原染色出现不均匀或呈斑片状，使用新鲜配制的试剂是避免这一问题的措施之一。另外，载玻片在每种溶液中浸泡的时间必须适当，且切片越厚所需时间越长；例如，4-5μm的切片完全脱蜡，至少需要2次二甲苯浸泡，每次5分钟；更厚的切片可延长时间或增加次数。
福尔马林固定会使组织蛋白质的氨基酸之间形成交联。虽然这一过程对于硬化组织和维持形态至关重要，但该过程也会掩盖抗原表位、降低抗原性，导致染色弱或无染色。抗原修复步骤可帮助恢复被掩盖的表位，从而获得最佳的染色效果。
热诱导抗原修复(HIER)：即在特定缓冲液中加热组织以破坏交联(图3)，相比于酶解法具有明显的优势。可选择的加热设备有微波炉、高压锅、水浴锅或高压灭菌器，高压锅和高压灭菌器可以在不发生剧烈沸腾的情况下将样本加热至100℃以上，微波炉也具备这个优势，且专业的实验室型号可以控制温度，但需要密切监控，并随时补充蒸发掉的缓冲液。水浴锅也能控制温度，并允许在较低温度下进行热诱导抗原修复，这可能非常适合某些特定的应用。无论选择哪种设备，都需要确定理想的温度(如果设备允许)和孵育时间。一般的建议是：从低温开始，根据需要逐渐升高，并在组织出现损伤迹象之前停止。
温度对抗原修复效果的影响比缓冲液的选择更为显著，缓冲液的pH值同样重要，柠檬酸盐和Tris体系溶液是最常用的选择。选择修复缓冲液时，可以优先参考抗体说明书，无说明书时需自行测试决定。
图3. 热诱导抗原修复原理图
样本制备的最后一步：使用PAP笔在切片周围画疏水屏障圈，能将试剂限制在特定区域内，避免同张载玻片上多种试剂混合。与传统PAP笔相比，ImmEdge® PAP笔(货号H-4000)具备以下特点：
➀. 适用于含或不含去污剂(Tween 20、Triton X-100等)的缓冲液，屏障稳定
➁. 浅蓝色疏水圈，清晰可见，兼容酶法与荧光检测系统
➂. 可溶于各类常用透明剂(如二甲苯等)，方便清理
➃. 环保：不含《蒙特利尔议定书》及欧盟理事会认定的破坏臭氧层的物质
规范的样本制作，不仅是染色成功的基石，更是确保镜检过程顺畅无忧的关键。每一步选择都必须贴合实验需求，任何环节操作不当都可能影响结果。唯有前瞻性的全盘考量、科学的决策以及全程使用优质试剂，方能确保实验圆满成功。
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