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染色较弱或没有染色	高背景染色	非特异性染色

一、染色较弱或没有染色：

细胞从盖玻片上脱离: 减少洗涤步骤或轻缓洗涤；用多聚赖氨酸将细胞黏合到盖玻片上

细胞没有被通透: 甲醇和丙酮固定能使细胞通透性增强；如果使用甲醛, 用0.2% Triton X-100通透细胞

细胞失水变干: 在整个染色过程中样品必须保持覆盖于液体中

细胞固定过度: 减少固定时间

一抗量不够: 提高抗体浓度；加长孵育时间；

孵育时间太短: 增加一抗和样品的孵育时间

切片储存问题: 样品处理之后应该应该马上成像，不然信号会随时间推移而减弱。如果需要可以将切片于 4⁰C 黑暗处储存。

一抗二抗不兼容: 二抗应该是抗一抗宿主的。例如，如果一抗是小鼠来源的，那就需要用抗小鼠的二抗；亚型需要兼容

一抗不适用: 确保抗体验证过可以用于ICC；先在免疫印迹中测试抗体, 确保抗体没有变质

储存问题: 反复冷冻/解冻是对抗体不利的，可引起降解. 最好是在收到产品时将其分成多个小份来保存；抗体没有按照建议的方式保存. 如果是这样的话可能需要重新购买一支；如果二抗没有在黑暗处保存 (使用免疫荧光时), 应更换一支新的二抗。

蛋白没有在检测的组织中出现: 做一个阳性对照；如果目标蛋白显现但是信号不强, 增加一个扩大信号步骤

二、高背景染色

抗体浓度太高: 稀释一抗/二抗

非特异结合: 做一个没有一抗的二抗空白对照.  如果有染色，说明二抗有非特异性结合，更换一种二抗。

阻断不够: 增加阻断孵育时间或考虑更换阻断剂。

信号放大过度: 减少信号放大孵育时间，稀释二抗

洗涤不充分: 步骤之间的适当洗涤非常重要. 确保遵循说明说上的洗涤步骤。

三、非特异性染色

抗体浓度过高: 降低抗体的浓度和孵育时间

一抗产自和待测样本来源同样的物种 (例. 小鼠抗小鼠): 尽量使用来自不同物种的一抗.  或者阻断内源IgG.  还可以尝试在孵育时使用1% Triton 来清洗组织.  或用TBS-Tween 20替换 PBS-Tween 20作为洗涤液。

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