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Tau蛋白是维持神经元结构和功能稳定的重要微管相关蛋白。然而，在阿尔茨海默病(AD)、额颞叶痴呆(FTD)和慢性创伤性脑病(CTE)等一系列被统称为“Tau蛋白病(Tauopathies)”的神经退行性疾病中，Tau蛋白会发生异常变化。其过度磷酸化后容易聚集形成神经原纤维缠结(NFTs)，持续破坏神经元网络，最终导致患者认知能力和运动功能逐渐衰退。

在近期的一项研究中，加拿大阿尔伯塔大学的科学家利用美国FDA批准的聚(D,L-乳酸-羟基乙酸共聚物)(PLGA)纳米颗粒，探究了纳米颗粒和温度对Tau蛋白聚集的影响。研究团队采用了多种生物物理学、生物化学及结构分析技术开展实验。纳米颗粒由于具有穿越血脑屏障的能力，通常被用于药物递送系统。而Paul等人在本研究中使用的是天然纳米颗粒，即未负载任何活性药物的PLGA纳米颗粒。此前研究表明，这类纳米颗粒能够在动物模型中抑制β-淀粉样蛋白(Aβ)的聚集。在此基础上，研究人员进一步考察了温度对不同Tau蛋白亚型体外聚集行为的影响。

Tau蛋白亚型来源于位于17号染色体上的微管相关蛋白Tau(MAPT)基因的可变剪接。在成年人大脑中，共表达6种不同的Tau蛋白亚型。其中，N端区域的可变剪接产生含有0个、1个或2个N端插入序列的亚型，分别称为0N、1N和2N；而微管结合结构域内的另一种可变剪接则产生含有3个或4个重复区域的亚型，分别称为3R和4R。在该微管结合结构域中，两段短肽序列——PHF6和PHF6*——已被证实是驱动Tau蛋白聚集的关键因素。

图1｜Tau蛋白亚型结构示意图。

随后，Paul等人采用实验室重组制备的0N4R Tau蛋白亚型，以及StressMarq公司提供的Tau-441(2N4R)野生型单体蛋白(货号：SPR-479)，开展了一系列体外Tau蛋白聚集实验。

研究人员使用肝素(heparin)诱导Tau蛋白聚集，并将实验温度设置在27℃至40℃之间，同时设置2.5 μM至20 μM不同浓度范围的Tau蛋白。随后，在40小时内利用硫黄素T(Thioflavin T，ThT)荧光检测法持续监测Tau蛋白聚集动力学变化。ThT是一种能够与Tau纤维中特征性的交叉β折叠(cross-β sheet)结构结合并产生荧光信号的染料，因此被广泛用于淀粉样蛋白聚集研究。研究结果显示，随着0N4R Tau蛋白浓度升高，其聚集程度明显增强。此外，温度升高不仅缩短了纤维形成前的滞后期(lag phase)，还加快了Tau蛋白的聚集速率，并且这一现象在所有测试浓度下均表现一致。

在另一组实验中，研究团队将温度固定在37℃，观察2N4R Tau蛋白的聚集情况。结果发现，2N4R Tau蛋白同样呈现出明显的浓度依赖性聚集趋势，即蛋白浓度越高，聚集程度越明显。最后，扫描透射电子显微镜(Scanning Transmission Electron Microscopy，STEM)分析进一步证实了上述结果。随着温度和Tau蛋白浓度的升高，研究人员观察到形成的聚集体尺寸逐渐增大，表明更高温度和更高蛋白浓度均有利于Tau蛋白聚集和纤维化过程的发生。

研究团队进一步开展实验，评估不同浓度PLGA纳米颗粒(5、10和20 μM)对Tau蛋白聚集动力学的影响。结果显示，PLGA纳米颗粒能够对10 μM浓度的0N4R Tau蛋白聚集产生剂量依赖性的抑制作用，且这一效果在所有测试温度条件下均可观察到。随着PLGA纳米颗粒浓度的增加，Tau蛋白形成纤维前的滞后期(lag phase)明显延长，而纤维生长的总体速率则有所降低。

扫描透射电子显微镜(STEM)分析显示，PLGA纳米颗粒能够直接与Tau纤维结合，并诱导其发生构象变化；这种构象变化在较高温度条件下更加明显。此外，双缩脲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白测定结果表明，可溶性Tau蛋白水平随着PLGA浓度的增加而升高。研究人员在2N4R Tau亚型中也观察到了类似趋势。尽管该实验仅在37℃条件下进行，但在最高浓度(20 μM)时，PLGA对2N4R Tau聚集的抑制作用较0N4R Tau更为显著。

为评估PLGA是否能够主动解离已经形成的Tau纤维，研究人员将预先形成的0N4R Tau聚集体分别在不同温度条件下与PLGA共同孵育，并设置不添加PLGA的对照组。Thioflavin T(ThT)荧光检测结果证实，PLGA纳米颗粒能够促进Tau纤维的解聚，而且随着温度升高，纤维解离的速率进一步增加。

随后，研究团队进一步考察了PLGA与不同构象Tau蛋白之间的相互作用。他们将0N4R Tau单体(monomers)、寡聚体(oligomers)和纤维(fibrils)分别与20 μM PLGA或不含PLGA的对照体系共同孵育。结果发现，PLGA纳米颗粒能够降低特异性抗体对Tau寡聚体和纤维某些位点的结合能力。对这些被遮蔽表位(epitopes)的分析表明，PLGA主要与Tau蛋白的**微管结合区域(microtubule-binding region，MTBR)以及C端结构域(C-terminal domain)**发生相互作用。值得注意的是，MTBR区域包含PHF6和PHF6两个关键基序，而这两个基序被认为是驱动Tau蛋白聚集过程的重要结构元件。