精准再进阶：肠高血糖素ELISA推动胰高血糖素检测特异性升级
胰高血糖素是血糖调控的核心调节因子，其作用机制在于它能刺激肝脏生成葡萄糖，多项研究已证实，胰高血糖素的调节失常与各种类型的糖尿病密切相关。胰高血糖素属于肽类激素，由分子量更大的前体蛋白——胰高血糖素原剪切加工而来。编码胰高血糖素原的GCG基因可在胰腺α细胞、肠道L细胞以及脑干中表达。由此合成的160个氨基酸长度的胰高血糖素原，可在多种不同类型的细胞中产生，而根据表达细胞内所含加工酶的差异，其翻译后加工过程会生成不同的蛋白产物。
图1. 展示了不同组织中，特异性激素原转化酶的差异表达对胰高血糖素原加工过程的调控作用。
检测胰高血糖素时，必须充分考虑胰高血糖素原的翻译后加工过程。因为最终生成的产物并非序列完全独立的蛋白，尽管胰高血糖素的作用可能独具特色，但它的序列却并非如此。这正是科研工作者多年来面临的核心检测难题。
尽管胰高血糖素主要由胰腺α细胞产生并分泌，但2016年有研究提出，肠道L细胞也可分泌胰高血糖素。这一发现源于研究人员在胰腺切除患者的循环血中检测到了胰高血糖素。此外，研究证实胰岛也可分泌少量GLP-1，且在糖尿病患者中其分泌量会升高。肠高血糖素、胃泌酸调节素以及胰高血糖素原1-61均为胰高血糖素原的衍生蛋白，三者都包含完整的胰高血糖素氨基酸序列。其中肠高血糖素和胃泌酸调节素主要由肠道L细胞产生并分泌，而胰高血糖素原1-61已被证实由胰岛α细胞产生。在特定代谢状态下，胰高血糖素原的加工过程会发生显著改变。
为满足高特异性胰高血糖素的检测需求，Mercodia分别于2013年和2014年推出两款胰高血糖素ELISA试剂盒（货号10-1271-01与10-1281-01）。两款试剂均采用双抗体法，分别靶向胰高血糖素肽段的两端。选择这一设计策略是因为已有研究报道存在多种截短型胰高血糖素，包括微型胰高血糖素、胰高血糖素3-29和5-29片段。
图2. Mercodia胰高血糖素ELISA中单克隆抗体的结合位点示意图
Mercodia研发了两种具有高特异性的小鼠单克隆抗体，并通过ELISA与表面等离子体共振(Biacore)技术完成了全面的性能表征。这两种抗体同时应用于两款胰高血糖素检测试剂中(图2)，交叉反应测试显示其具有优异的特异性(表1)。
初步的特异性测试涵盖了循环中含量显著的胰高血糖素原衍生蛋白。后续研究进一步检测了Mercodia胰高血糖素ELISA试剂盒(10-1271-01)对胰高血糖素原1-61与胰高血糖素3-29的交叉反应——这两种肽段在人体样本中的研究数据更为充分。Biacore分析证实，捕获抗体结合全长胰高血糖素的亲和力是结合胰高血糖素原1-61的70倍。
表1. Mercodia 胰高血糖素 ELISA 的特异性数据
检测物质 | 交叉反应率(%) | 最高检测浓度(pmol/L) |
肠高血糖素 | 0.8 | 300 |
胃泌酸调节素 | 4.4 | 135 |
微型胰高血糖素 | <0.1 | 1600 |
胰高血糖素样肽 - 1(GLP-1) | <0.3 | 500 |
胰高血糖素样肽 - 2(GLP-2) | <0.3 | 500 |
胰高血糖素原相关多肽(GRPP) | <0.0005 | 300000 |
GlucaGen(注射用重组胰高血糖素) | 100 | 100 |
Mercodia通过严格筛选抗体克隆，实现了真正的夹心结构：只有完整胰高血糖素存在时，才能形成双抗体夹心结构，从而避免与包含完整胰高血糖素序列(如肠高血糖素)或部分序列(如微型胰高血糖素)的同源蛋白发生交叉反应。
自上市以来，Mercodia胰高血糖素ELISA已成为全球科研工作者的首选检测方案(图 3)，广泛应用于胰岛研究、糖尿病治疗、肥胖、非酒精性脂肪肝/非酒精性脂肪性肝炎(NAFLD/NASH)、营养学、代谢组学、胰高血糖素生物合成与分泌等多个领域。
图3. Mercodia胰高血糖素ELISA发表文献数量增长趋势
2018年，德国研究团队在《Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism》发表了一项研究，分析了口服葡萄糖耐量试验(oGTT)过程中的胰高血糖素动态变化，以探究高胰高血糖素血症在2型糖尿病中的作用。研究同时采用Mercodia胰高血糖素ELISA试剂盒(10-1271-01)与市售放射免疫分析法(RIA)，检测了oGTT五个时间点的血浆胰高血糖素水平。结果显示，两种方法的检测结果存在差异。
具体而言，RIA检测无法准确反映oGTT过程中血浆胰高血糖素的抑制效应。研究者认为，ELISA对胰腺来源胰高血糖素的灵敏度与特异性均显著优于RIA，因此研究全程采用Mercodia ELISA的胰高血糖素数据进行分析。讨论部分，研究者强调了高特异性胰高血糖素检测试剂对于研究餐后胰高血糖素动态变化的重要性。并指出，RIA会严重低估胰高血糖素的餐后抑制程度，根源在于试剂会与胰高血糖素原剪切产生的其他肽段(如胃泌酸调节素、肠高血糖素、微型胰高血糖素)发生交叉反应，餐后肠道分泌的这些肽段水平升高，掩盖了胰高血糖素的抑制变化。因此研究者推荐使用Mercodia的夹心ELISA试剂——其抗体同时靶向胰高血糖素分子的N端与C端，从原理上规避了交叉反应问题。
在此之前，作为胰高血糖素原衍生物之一的肠高血糖素，一直因缺乏商业化检测试剂而难以定量研究。2014年，Mercodia肠高血糖素ELISA(货号 10-1273-01)正式上市，为肠高血糖素分泌生理机制的研究提供了可靠的工具支持。
该试剂盒采用了一种识别胰高血糖素序列的抗体，搭配另一种识别与胰高血糖素原相关的多肽序列(图4)，可对人血清、EDTA血浆及细胞培养基中的肠高血糖素进行准确定量。此外，该试剂与胰高血糖素、胃泌酸调节素、微型胰高血糖素、GLP-1、GLP-2 均无交叉反应。
图4. Mercodia肠高血糖素ELISA中单克隆抗体的结合位点示意图
当剑桥的研究团队发现减重术后患者肠高血糖素水平大幅升高、可能干扰胰高血糖素检测时，他们联系了Mercodia。双方的沟通与合作，最终推动了胰高血糖素ELISA实验方案的开发与验证。这款优化方案的抗体特异性靶向胰高血糖素N端与C端，从原理上避免与含同源序列的蛋白发生交叉反应，而残留的少量交叉反应，源于抗体的低亲和力非特异结合。因此，在实验流程中增加一步洗涤，即可进一步降低交叉反应。新增洗涤步骤的优化方案，显著降低了胃切除术组受试者餐后样本的胰高血糖素检测值，而对照组的空腹与餐后样本，胰高血糖素检测结果未出现明显下降。这说明，胃切除术组餐后样本中，原本的 “胰高血糖素” 检测值实际包含了大量肠高血糖素的干扰信号，而优化方案彻底消除了这一交叉反应。
图5. 不同实验方案检测的胰高血糖素浓度示意图，a)对照组；b) 胃切除术组
与剑桥Gribble团队的合作促成了Mercodia胰高血糖素ELISA(货号10-1271-01)实验方案的开发。该优化方案可提供更高的检测特异性，适用于特定研究场景——比如减重术后、肾病，以及外源性给予胰高血糖素原衍生物的研究，这些场景下肠高血糖素、胰高血糖素原1-61与胃泌酸调节素的水平会升高至可能干扰检测的程度。
研究团队对优化方案进行了全面验证，评估了其检测限、交叉反应(表2)、干扰效应、稀释线性、平行性、样本相关性等方面的性能指标。
检测物质 | 交叉反应率(%) | 最高检测浓度(pmol/L) |
肠高血糖素 | 0 | 600 |
胃泌酸调节素 | 0/2.1 | 40/600 |
胰高血糖素3-29 | 0 | 1000 |
胰高血糖素原1-61 | 0/2.1 | 25/1000 |
表2. 胰高血糖素ELISA优化方案的交叉反应数据
优化方案在最大程度降低所有受试胰高血糖素原衍生物交叉反应的同时，未显著改变原方案的灵敏度、抗干扰能力、稀释线性、平行性与样本相关性。依据ISO11843第4部分的方法学标准，该方案的检出限≤1 pmol/L；稀释线性平均回收率为103%(范围 99%~108%)，平行性实验平均回收率为106%(范围98%~120%)；优化方案与原实验方案的样本检测结果相关性优异(R²>0.98)。
综上，Mercodia高特异性胰高血糖素ELISA经与剑桥研究团队合作验证，证实其在存在高浓度胰高血糖素原衍生物(干扰物)的场景下，仍能保持精准的检测性能。
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