Alpha-突触核蛋白操作指南(1)——硫黄素T检测
硫黄素T检测
硫黄素T (Thioflavin T) 是一种荧光染料，可以和富含β折叠的结构结合，例如α-突触核蛋白原纤维。一旦结合，硫黄素T的发射光谱就会发生红移 ，并且荧光强度会增强，这是一个很好的用来检测原纤维形成的测试。
以下是用α-突触核蛋白前体原纤维和单体做的硫黄素T检测的操作指南。
▶ 用蒸馏水制备1mM硫黄素T储备溶液 (新鲜制备并使用0.2μm 注射器过滤器过滤)
▶ 用PBS pH 7.4稀释硫黄素T，确保每个孔中的硫黄素T最终浓度为25μM(每孔溶液体积=100μL). 孔板: Lumox96多孔孔板 (Sarstedt Catalog # 94.6000.024)
▶ 在将要使用之前才把alpha突触核蛋白小份在室温下解冻
▶ 在相应的孔中加入10μM 前体原纤维或者100μM 单体 (或两者都有). 用移液器将孔中液体上下吸入排出混合. 浓度为估计值，需要优化来得到好的信号，并避免浪费
▶ 在密封孔板然后置于震荡孵育器中 (600rpm)，37°C孵育
▶ 用Molecular Devices Gemini XPS微孔板读板机读取荧光读数，使用软件是Softmax Pro版本为6.5.1
XPS 酶标仪设置参数:
温度：37°C
读取形式：孔板扫描
波长：激发光450nm，发射光485nm
PMT增益：自动
闪光每读：6
震荡：读数前20秒
▶ 再次密封孔板置于震荡孵育器下37°C
▶ 1到72小时常规区间读数
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