用于检测神经退行性疾病中错误折叠蛋白的新型化学发光测定法
阿尔茨海默病、帕金森病以及肌萎缩侧索硬化症(ALS)等神经退行性疾病的特征，是大脑中错误折叠蛋白聚集的逐渐积累。这些异常的蛋白构象会破坏正常的细胞功能，引发神经炎症和细胞死亡。这些通常可溶的蛋白会聚集形成富含β-折叠结构的纤维，并进一步在整个大脑中诱导毒性级联反应。这种类型的神经退化被称为蛋白质病变，在老年人中日益常见。然而，错误折叠蛋白的早期检测和监测一直具有挑战性。现有检测方法普遍存在灵敏度不足、背景荧光干扰较大，以及在活体组织中应用效果不理想等问题。其中最具代表性的工具是荧光染料硫代黄素T(ThT)，它被广泛用于识别β-折叠结构。
为了解决这一问题，麻省总医院/哈佛医学院 Athinoula A. Martinos 生物医学成像中心的研究人员开发了一种新的化学发光探针。该探针既可用于对β-折叠结构进行广泛检测，又能够实现对特定错误折叠蛋白的精准识别。在最近发表在bioRxiv 上的一篇预印本论文中，Zhu等人将他们的探针ADLumin-1 与ThT在多种与蛋白质病变相关的肽和蛋白上进行了测试。他们将这些蛋白称为“misfoldon”，因为它们共享与此类错误折叠蛋白相关的共同β-折叠结构。此外，这些蛋白通常含有丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸等氨基酸。这些氨基酸可以在β-折叠结构中形成疏水性口袋。
ADLumin-1特异性结合β-折叠结构其效果优于ThT
在观察到ADLumin-1在淀粉样β纤维存在时化学发光信号增强后，Zhu等人确定，ADLumin-1是沿β-折叠纤维的长轴，与其内部的疏水性口袋发生结合。这种结合方式与ThT类似。基于这些发现，Zhu等人假设ADLumin-1可以作为一种针对β-折叠结构的通用探针。为验证这一点，他们使用了模型肽PA-K2和PA-E2——这两种肽可形成β-折叠纤维(富含Val/Ala)。此外，他们还使用了肽PA-K和PA-E，这两种肽也能组装成纤维，但不具有大量β-折叠结构。
研究人员表明，与背景相比，ADLumin-1在PA-K2存在下的化学发光增强了4,168倍；而在PA-K中仅约为248倍，对应强度比为16.8。与ThT相比，在PS-K2孵育条件下，ADLumin-1的信噪比比硫代黄素T高127.7倍。在PA-E/PA-E2肽中也得到了类似结果。在证明了ADLumin-1能够以高于ThT的灵敏度特异且稳定地结合β-折叠结构之后，研究人员决定将其与一系列与疾病相关的misfoldon进行测试。
将其分别与StressMarq的Tau(K18)P301L突变体预制原纤维(目录号 SPR-330)、α-突触核蛋白、淀粉样β以及TDP-43纤维混合后，均检测到了强烈的化学发光信号，其信噪比优于ThT。与ThT相比，ADLumin-1使α-突触核蛋白的信噪比提高了83倍，淀粉样β提高了75倍，tau提高了15倍，TDP-43提高了11倍。此外，ADLumin-1还能够区分单体与纤维，并能够检测寡聚体。不同misfoldon之间信号衰减半衰期的差异表明，ADLumin-1有可能用于区分它们。分子对接实验进一步证实，ADLumin-1沿β-折叠纤维的长轴结合，并与由Ala、Val、Ile和Phe形成的疏水通道发生作用，这种对接方式解释了其对多种靶标的广泛适用性。
图1.［引自 StressMarq 网站］Tau(K18)P301L突变体预制原纤维(PFFs)(目录号：SPR-330)的透射电子显微镜(TEM)图像
ADLumin-1可用于Tau和TDP-43的体内成像
Tau是与阿尔茨海默病(AD)密切相关的关键蛋白，它会在患者大脑中聚集并形成缠结。在对AD患者脑切片进行染色时，ADLumin-1能够与抗Tau抗体实现共定位。在野生型(WT)和tau P301突变小鼠中，注射ADLumin-1后，利用动物成像系统在不同时间点记录化学发光信号。在突变型与WT小鼠之间观察到了显著的化学发光差异。这两项关于Tau的研究均表明，ADLumin-1能够在体内有效检测Tau缠结。
在肌萎缩侧索硬化症(ALS)中，TDP-43会在大脑和脊髓的运动神经元中发生聚集。在对野生型和A315T转基因小鼠(ALS模型)进行的类似实验中，经静脉注射探针后，A315T小鼠的信号高于WT小鼠。在A315T小鼠切片中，ADLumin-1检测到了包涵体，并通过与抗体的共定位得到了验证。
通过ChRET可增强α-突触核蛋白的体内成像
在帕金森病(PD)中，α-突触核蛋白的聚集起核心作用，会形成具有毒性的寡聚体和纤维。因此，无论在体外还是体内实现对α-突触核蛋白的可靠检测，对于PD研究都具有重要意义。Zhu等人能够以飞摩尔级别的灵敏度检测α-突触核蛋白，优于ThT。通过结合蛋白错误折叠循环扩增(PMCA)和“种子”诱导方法，他们成功在脑脊液(CSF)中检测到α-突触核蛋白。这一检测为其在体外诊断中的应用提供了可能。重要的是，ADLumin-1同样能够在PD患者脑组织中检测到α-突触核蛋白，这一点至关重要，因为它有望应用于脑组织的死后分析。
在研究人员开展的体内实验中，将α-突触核蛋白聚集体经颅内注射至小鼠，并用ADLumin-1进行标记。随后，他们采用三维弥散发光成像断层技术(DLIT)。该技术仅在接种部位检测到局部化学发光信号，从而证实了对脑深部α-突触核蛋白的选择性检测。在腹腔注射ADLumin-1后，过表达人α-突触核蛋白的转基因A53T小鼠，其脑部信号较野生型高出2.1倍。在4至12个月的纵向分析中，A53T与WT小鼠之间的信号比上升至2.6倍，与疾病进展趋势相一致。随后，研究人员通过离体组织学染色验证了α-突触核蛋白的积累。
在确认ADLumin-1能够在体内追踪α-突触核蛋白传播后，研究人员进一步开发了一种方法，以同时增强信号并实现对α-突触核蛋白的选择性成像。他们采用了一种生物正交的化学发光共振能量转移(ChRET)技术，将作为化学发光供体的ADLumin-1与荧光受体配对。该受体可特异性结合α-突触核蛋白(CRANAD-14)。采用该方法，可在活体转基因A53T小鼠脑中实现对α-突触核蛋白的精确成像，并能够与阿尔茨海默病转基因小鼠模型(5xFAD)中的错误折叠淀粉样β加以区分。
总 结
ADLumin-1的信噪比最高可达ThT的128倍，是一种用于检测与神经退行性相关的错误折叠蛋白的有前景的新型试剂。淀粉样β、tau、α-突触核蛋白和TDP-43等蛋白会发生病理性聚集，形成纤维，并呈现出ADLumin-1可结合的疏水性β-折叠结构。此外，这种化学发光探针还具有更高的灵敏度、无自发荧光以及可实现深层组织穿透等优势。它能够以飞摩尔级灵敏度在脑脊液中检测α-突触核蛋白，并能在活体转基因小鼠疾病模型中对tau、α-突触核蛋白和TDP-43的聚集体进行无创可视化，这是ThT无法实现的。
此外，当研究人员将ADLumin-1与其开发的荧光探针CRANAD-14结合，应用于生物正交的ChRET检测体系时，他们能够在活体小鼠大脑中对α-突触核蛋白进行精确成像，并区分α-突触核蛋白与淀粉样β。这种高灵敏度的体内技术有望成为研究和监测多种蛋白质病变的重要工具。
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参考文献
1. Highly sensitive chemiluminescence imaging of misfolded proteins in neurodegenerative models. Zhu, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
2. Detection of misfolded proteins in neurodegenerative disease models with a highly sensitive chemiluminescence. Zhu, B. et al., bioRxiv, (preprint)
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