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在免疫效应功能研究和药物诱导细胞毒性评价等广泛的体外应用中，细胞死亡定量检测是核心环节。乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）释放试验操作简便、可规模化，被广泛用于评估细胞膜完整性损伤。本文综述了LDH检测法的基本原理与固有局限性，并重点阐述如何通过优化显色读数系统来提升检测的可靠性。

1 LDH释放：细胞毒性标志物

1.1 细胞毒性检测方法概述

细胞毒性（Cytotoxicity）涵盖了细胞对损伤性刺激产生的一系列反应谱，从细胞功能的短暂改变到不可逆的膜损伤及细胞死亡。历史上，研究者开发了多种方法来定量检测体外细胞死亡：

• 铬⁵¹（Chromium，Cr⁵¹）释放试验：虽然具有高灵敏度，但涉及电离辐射危害和法规限制¹

• 荧光标记法（如膜不通透性DNA染料（如碘化丙啶，Propidium Iodide）、胺反应性活性染料）：可实现敏感的单细胞分析，但需要专门的仪器和多步骤流程，限制了其可扩展性²

这些限制促使比色法LDH释放试验成为常规细胞毒性评估的实用替代方案^1,2。

1.2 膜损伤后的LDH释放

LDH是一种稳定的胞质酶，参与乳酸代谢循环。细胞膜破裂后，LDH迅速释放至细胞外环境，其活性可用于评估多种细胞死亡方式，包括坏死（Necrosis）、坏死性凋亡（Necroptosis）和焦亡（Pyroptosis）。在细胞凋亡（Apoptosis）、铁死亡（Ferroptosis）或氧化性细胞死亡（Oxidative Cell Death）的晚期阶段，一旦质膜被破坏，也可检测到LDH释放。因此，LDH活性检测主要反映的是细胞膜完整性的丧失，而非细胞死亡的具体机制。

1.3 比色法LDH检测原理

LDH活性通过酶促反应进行测定：LDH将乳酸氧化为丙酮酸，同时将NAD+还原为NADH。随后，NADH在催化剂（如黄递酶（Diaphorase）或吩嗪类电子介体）的作用下驱动四唑盐还原，生成有色（传统为红色）的甲臜（Formazan）产物，可通过分光光度法定量1-4。甲臜信号与细胞外LDH活性成正比，可提供定量且线性的细胞膜破坏程度指标。

图1：比色法LDH释放测定原理。

图示为受损细胞释放LDH的过程，以及使用基于甲臢的比色法进行定量分析。底部图示为孔内培养基颜色的变化，使用LDH-Blue™ Plus（InvivoGen）时，培养基颜色由浅橙色变为蓝紫色；而使用传统检测方法（竞品）时，培养基颜色则变为橙红色，二者颜色变化与LDH活性成正比。

*插图由BioRender.com 创建。

1.4 传统LDH检测法的局限性

尽管基于红色甲臜的传统LDH检测法应用广泛，但仍存在一些可能影响数据解读的局限性3：

▷ 与培养基中的酚红（Phenol Red）光谱重叠，导致背景信号升高

▷ 自发释放LDH产生的高基线信号，可能掩盖低水平细胞毒性

▷ 由于背景信号和基线信号均较高，动态范围受限

▷ 在高密度培养条件下，检测线性下降

这些问题共同凸显了改进LDH检测设计以增强信号分辨能力的必要性。

2 LDH-Blue^™ Plus：克服关键限制

2.1 改进比色读数

克服上述局限的一种有效途径在于重新设计显色输出系统。将反应产物从红色甲臜转变为蓝色甲臜，通过这一光谱转移，可以使信号生成与培养基中酚红产生的背景吸光度解耦。研究人员通过细胞裂解试验，直观比较蓝色（LDH-Blue^™ Plus, InvivoGen）与红色（竞品）甲臜的显色效果，评估光谱偏移对肉眼观察的影响。

图2：使用蓝色甲臜肉眼清晰检测LDH活性。

将THP1-Null2细胞以递减的密度接种于含酚红的RPMI培养基（含裂解缓冲液）中培养30分钟。使用LDH-Blue^™ Plus（InvivoGen）或两款竞品的LDH检测试剂盒定量检测上清液中的LDH活性。反应在LDH检测试剂加入孔板后立即开始，并随时间推移而进行。

传统红色甲臜信号在视觉上容易与培养基颜色混杂。与红色甲臜不同，蓝色甲臜信号便于肉眼监测反应进程和最佳终止时间。这种明显的蓝紫色变化提高了实验的易用性，并降低了信号饱和的风险。

2.2 扩大检测范围

我们评估了光谱偏移对LDH释放检测范围（即最大与最小吸光度信号之差）的影响。最大吸光度信号通过完全细胞裂解获得；最小吸光度信号包括背景吸光度（来自酚红和添加到培养基中的血清中的LDH的信号）和基线吸光度（测试细胞自发释放的LDH）。

结果显示，在含酚红的RPMI培养基中，传统的LDH检测范围受限，因为它们会检测到来自酚红的背景信号。相比之下，LDH-Blue^™ Plus避免了来自酚红的背景信号干扰，从而能够更清晰地区分低水平和高水平的细胞毒性。

图3：使用红色或蓝色甲臜读数的细胞毒性检测范围。

将THP1-Null2细胞（2x10^⁵）在含酚红的RPMI培养基（添加/不添加裂解缓冲液）中培养30分钟。使用LDH-Blue^™ Plus（InvivoGen，650nm波长吸光度）或两款竞品的LDH检测试剂盒（490nm波长吸光度）定量LDH活性。检测范围以未处理细胞与完全裂解细胞的LDH活性信号比值计算。数据以平均值±SEM表示。

这些数据表明，使用蓝色甲臜可提高检测灵敏度，这对早期药物筛选或低细胞毒性监测等应用至关重要。此外，无需为检测调整细胞培养条件。

2.3 确保线性关系

准确的细胞毒性定量依赖于甲臜生成量与细胞膜破坏程度成正比这一前提。为了评估这种关系，我们分析了多种细胞类型（包括贴壁和悬浮细胞）中LDH信号与细胞密度的相关性。

图4：裂解细胞数量与释放的LDH活性之间的关系。

将不同数量的(A)THP-1人单核细胞、(B)RAW264.7小鼠巨噬细胞、(C)A549人肺癌细胞或(D)人外周血单核细胞（PBMCs）在裂解缓冲液中培养30分钟。使用InvivoGen的LDH-Blue^™ Plus（650nm波长吸光度）或两种竞品LDH检测试剂盒（490nm波长吸光度）定量上清液中的LDH活性。数据以平均值±SEM表示。每种LDH检测试剂盒的线性回归R^²值见图。

传统的LDH检测在较高信号强度时，表现出偏离线性的趋势，可能源于背景和基线吸光度的增加所致。相比之下，LDH-Blue™ Plus在细胞密度和LDH活性之间保持了良好的线性相关性（R^²>0.97）。

通过最小化背景干扰并保持信号比例性，蓝色甲臜读数能够在各种实验条件下实现一致且可靠的定量分析。这减少了在检测前对细胞密度进行严格优化的必要性。

2.4 提高检测精度

焦亡是炎症小体激活的主要结果，通常通过定量检测LDH释放来评估。我们在NLRP3炎症小体激活模型中比较了LDH-Blue^™ Plus与竞品的检测效果。

使用THP-1人单核细胞（炎症小体研究的经典细胞模型）在96孔板以2×10⁵细胞/孔的密度接种。用NLRP3激活剂尼日利亚菌素（nigericin）处理细胞。当使用蓝色或传统红色甲臜检测方法进行检测时，两种检测方法均显示在上清液中LDH呈剂量依赖性释放。

然而，传统红色检测方法报告的LDH活性系统性地高于LDH-Blue^™ Plus。更重要的是，在这种细胞密度下，传统红色检测方法的信号不再呈线性关系。

图5：使用红色或蓝色甲臜读数对细胞焦亡进行定量检测。

将THP1-Null2（2x10^⁵）用1μg/ml LPS-EK预处理3小时，然后用递增浓度的尼日利亚菌素孵育以诱导细胞焦亡。6小时后，使用InvivoGen的LDH-Blue^™ Plus或两种竞品LDH检测试剂盒定量检测释放的LDH活性。结果以细胞裂解后的最大LDH释放量进行标准化（平均值±SEM）。

传统红色检测方法在超出线性范围时，焦亡测量的准确性受到影响，导致细胞死亡的高估。这种偏差会干扰数据的正确解读，尤其是在评估药物化合物毒性时。

因此，我们检测了基于蓝色和传统红色甲臜的LDH释放检测方法的准确性，并将其与使用胺反应染料测量细胞膜完整性的流式细胞术参考方法（Live/Dead^®检测）进行了比较。

图6：细胞死亡定量准确性的比较。

将THP1-Null2（2x10^⁵）与0.3μM星形孢菌素共同培养24小时以诱导晚期凋亡。与裂解缓冲液共同培养30分钟作为阳性对照。使用Live/Dead^® assay流式细胞术试剂盒（Invitrogen, #L34966、InvivoGen的LDH-Blue^™ Plus或两种竞品LDH检测试剂盒测定释放的LDH活性来定量细胞死亡。结果以相对于Live/Dead^®检测结果的细胞死亡百分比表示（平均值±SEM）。相对于Live/Dead^®检测结果，细胞死亡高估的程度以红色标出。

在细胞毒性后期（星形孢菌素诱导的细胞凋亡）中，传统LDH释放检测方法报告的表观细胞毒性高于流式（分别为+21%和+41%），而LDH-Blue^™ Plus检测方法与流式的结果非常接近（+1%）。

总体而言，这些研究结果表明，传统LDH检测中升高的背景和基线吸光度会引入系统误差，从而夸大表观细胞毒性，尤其是在膜损伤有限或发生在早期阶段的情况下。LDH-Blue™ Plus可最大限度地减少高估，并提供与参考检测方法一致的细胞毒性测量结果。

2.5 支持可重复性

试剂稳定性是决定实验可重复性的关键因素。

☆ LDH-Blue^™ Plus在4°C储存一个月后，仍能保持稳定的信号强度和动态范围，同时维持线性关系。

☆ 相比之下，传统LDH检测方法在储存后会出现信号强度降低、动态范围缩小，表明试剂性能下降。

图7：试剂在4°C储存后的性能稳定性。

使用递增数量的裂解THP1-Null2细胞生成LDH释放信号，分别使用(A)InvivoGen的LDH-Blue^™ Plus（650nm吸光度）或(B,C)两种竞品LDH检测试剂盒（490nm吸光度）进行测量。检测使用现配的试剂混合物或在4°C下储存1个月的试剂混合物进行（平均值±SEM）。

LDH-Blue^™ Plus在4°C储存期间确保信号稳定，避免实验间差异，支持常规工作流程中的可靠定量。

3 结论

LDH 释放试验是细胞毒性定量的常用工具，但依赖红色甲臜的传统检测方法存在一些局限性，会影响测量的可靠性，需要大量的优化。

LDH-Blue^™ Plus基于蓝色甲臜的比色读数系统，从红色到蓝色的转变改善了信号分辨能力，减少培养基中酚红的背景干扰，从而实现了：

▶ 灵敏度：更大的检测范围

▶ 准确度：更高的信号线性度

▶一致性：更稳定的线性度，便于跨实验和跨实验室数据的精确比较

此外，LDH-Blue^™ Plus还为常规工作流程提供多项实用优势：

◑ 清晰的肉眼观察反应监测和最佳终止时间

◑ 与标准含酚红培养基的兼容性以及在各种细胞密度下均能进行稳健的定量分析，从而减少了优化需求

◑ 此外，该试剂盒经过特殊设计，可在4°C储存时提高试剂稳定性。

综上所述，这些特性使LDH-Blue^™ Plus成为研究和筛选应用中准确评估细胞毒性的可靠且易于使用的解决方案。

*本文为 InvivoGen 原创，版权归 InvivoGen 所有。

参考文献

1. Korzeniewski, C. & Callewaert, D. M., 1983. J Immunol Methods. 64(3):313-320.

2. Cummings, B. S. & Schnellmann, R. G., 2004. Curr Protoc Pharmacol. 12(12.8). 

3. Kaja, S. et al., 2017. Curr Protoc Toxicol. 72:2.26.1-2.26.10. 

4. Decker, T. & Lohmann-Matthes, M. L., 1988. J Immunol Methods. 115(1):61-9. 

研究工具

InvivoGen的LDH-Blue™ Plus是一款全新且更稳定的创新型比色法检测试剂盒，用于测定受损或裂解细胞培养上清液中的LDH活性。该试剂盒采用可生成蓝色甲臜产物的底物，使培养基颜色由淡红色变为蓝紫色。

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