深圳欣博盛生物科技有限公司

在题为“Advanced Alzheimer’s Disease Models Using iPSC‑derived Microglia and Neurons Harboring Disease‑related Gene Variants”的海报中，Shatri等人(1)使用CRISPR/Cas‑9技术在人体iPSC中引入与痴呆相关的突变，并将其分化为微胶质细胞。在野生型细胞系的基础上，研究人员还构建了七种不同的突变细胞系：APOE2/2、APOE3/3、APOE4/4、APOE基因敲除、TREM2R47H、GRN+/−以及GRN基因敲除。

APOE基因(载脂蛋白E)具有2、3和4三种等位基因，它们分别对应不同的阿尔茨海默病风险水平。其中，APOE4/4与最高的患病风险相关，而APOE2/2则被认为具有神经保护作用(2)。 此外，在TREM2基因(髓系细胞触发受体2)中携带特定的TREM2R47H突变的人群，其罹患阿尔茨海默病的风险也显著升高(3) 。GRN基因(颗粒蛋白)功能缺失突变主要与额颞叶变性(FTLD)相关，但也可能在阿尔茨海默病中发挥作用(4)。

在获得这些细胞系后，研究人员通过检测经典微胶质细胞标志物来进行验证。免疫染色结果显示，所有编辑后的细胞系均稳定表达IBA‑1、TMEM119、TREM2和P2Y12R，这表明其微胶质细胞特性得以保持。同时，还对突变基因在这些细胞系中的表达水平进行了定量分析。该验证结果证明，这一模型在遗传背景上准确可靠，并且在表型上确实属于微胶质细胞，为后续功能研究奠定了基础。

作者在不同细胞系中检测了细胞因子的释放情况，这些细胞在受到病理性刺激或免疫激活因子处理后产生反应。病理性刺激包括StressMarq公司的β淀粉样蛋白1‑42预形成纤维(货号SPR‑487)和β淀粉样蛋白1‑42寡聚体(货号SPR‑488)；免疫激活因子包括IFN‑γ、LPS和TNF‑α。

图1：[图片来源：StressMarq官网]透射电子显微镜(TEM)图像显示了β淀粉样蛋白1‑42单体(货号SPR‑485，左)、β淀粉样蛋白1‑42寡聚体(货号SPR‑488，中)以及β淀粉样蛋白1‑42预形成纤维(货号SPR‑487，右)。

随后，研究人员通过细胞因子的释放水平评估各细胞系对免疫刺激的响应能力。值得注意的是，在IFN‑γ处理后，APOE2/2型微胶质细胞释放的IL‑6显著高于其他APOE基因型以及APOE敲除细胞。这一结果表明，APOE等位基因状态会调节微胶质细胞对细胞因子刺激的炎症敏感性。

在野生型微胶质细胞中，β淀粉样蛋白寡聚体可诱导IL‑6、IL‑18和TNF‑α水平升高。有趣的是，这种效应在β淀粉样蛋白纤维处理时并未观察到，这与寡聚体在诱导炎症反应方面具有更高生物活性的观点一致。

关键的是，TREM2R47H突变的微胶质细胞在面对β淀粉样蛋白寡聚体时，并未产生相同水平的细胞因子反应，这表明这一与阿尔茨海默病相关的TREM2变异可能削弱或改变了微胶质细胞对寡聚体β淀粉样蛋白的识别或信号传导过程。此外，研究人员还通过给予不同梯度剂量的IFN‑γ、TNF‑α和LPS，测定了各细胞系的剂量依赖性响应。

吞噬能力是微胶质细胞的一项关键功能，与清除β淀粉样蛋白密切相关。研究人员使用结合了pHrodo染料的β淀粉样蛋白寡聚体和大肠杆菌颗粒，对不同APOE基因型的吞噬过程进行了实时监测。pHrodo是一种在酸性环境(如吞噬体内部)中荧光增强的染料，因此非常适合用于追踪吞噬过程。

研究结果显示，与APOE4/4和APOE敲除细胞相比，APOE3/3微胶质细胞对β淀粉样蛋白寡聚体的摄取更高，这表明APOE基因型会影响微胶质细胞内化寡聚体β淀粉样蛋白的能力。鉴于APOE4与更高的阿尔茨海默病风险密切相关，APOE4型微胶质细胞在清除寡聚体方面吞噬能力降低，可能是其致病作用的功能性原因之一。不过，尽管存在遗传差异，所有细胞系仍保留了吞噬细菌颗粒和β淀粉样蛋白的基本能力，这说明基因型主要影响的是吞噬效率，而非完全丧失该功能。

为了提高模型的生理相关性，研究团队在现有基础上改进了共培养方案，将NGN2诱导的神经元与来源于iPSC的微胶质细胞共同培养。免疫染色结果证实，在共培养体系中既存在神经元标志物(β‑Tubulin、MAP2)，也存在微胶质细胞标志物(IBA‑1、TREM2、TMEM119)，从而可以在神经元信号存在的条件下研究微胶质细胞的反应，并对细胞间相互作用进行动态观察。